mtt细胞存活率计算公式
MTT测定细胞的存活率
实验材料:
1)试剂:
MTT、DMSO、DMEM、PBS。
2)材料:
15mL离心管、1.5mL EP管、1mL和200μL头、排槽，在实验前准备好，121C 30min 灭菌后置于超净台中。96孔培养板为一次性塑料制品。
3)仪器:
超净台、CO2培养箱、显微镜、离心机、单道及八道移液、细胞计数板，酶标仪等。
实验操作:
1)种板:
a.准备工作:保证超净台中有15mL的离心管和1mL头，将细胞计数板和盖玻片用擦镜纸擦干净;
b.使用移液将培养皿中的细胞吹下来,转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min;
c.离心完后用移液吸去。上清，加入3mL新鲜培养基，轻轻吹打50下，使细胞在培养基中分布均匀成为单细胞悬液，从中取出20μL稀释到200μL，在从中取出20μL加到细胞计数板上进行细胞计数，所得的数据乘以10即为细胞的浓度;
d.以96孔板上每孔1X 104个细胞，每孔150μL计算细胞浓度，将细胞悬液稀释到所需的浓度，放到排槽中，用八道移液加样，注意为了消除边缘效应，周围一圈的孔都不加样，而倒数第二排加入培养其作为对昭，这样口需在7~11列、B_F排加入细朐县液.
e.细胞加好后，轻轻晃动培养板使细胞分别均匀，然后在周围一.圈的孔中加入200μL PBS，在显微镜下观察后，置入培养箱中。
2)加药:
细胞在培养箱中培养24小时后就可以加药诱导了。
a.准备工作:保证超净台中有1.5mL EP管和1mL及200μL.头，
b.配药:因为现在每孔是150μL培养基，加入50μL的药物总体
积为200μL,故配药的浓度为最终浓度的4倍,按浓度梯度使用1.5mLEP管配制不同浓度的药物,
c.加板:然后使用200μL的移液将配好的药物加入培养板中，每孔50μL，最后置入培养箱中。
3)显色:
诱导到规定的时间就可以加MTT显色了。a.准备工作:配制MTT溶液(用PBS将MTT配成5mg/mL溶液，注意避光) ; b.将配好的MTT溶液，以每孔20uL的量加入到培养板中，再置入培养箱中: c.4小时1000rpm离心5min;
c.离心完后用移液吸去。上清，加入3mL新鲜培养基，轻轻吹打50下，使细胞在培养基中分布均匀成为单细胞悬液，从中取出20μL稀释到200μL，在从中取出20μL加到细胞计数板上进行细胞计数，所得的数据乘以10即为细胞的浓度;
d.以96孔板上每孔1X 104个细胞，每孔150μL计算细胞浓度，将细胞悬液稀释到所需的浓度，放到排槽中，用八道移液加样，注意为了消除边缘效应，周围一圈的孔都不加样，而倒数第二排加入培养其作为对昭，这样口需在7~11列、B_F排加入细朐县液.后将板中的培养基倒掉，每孔加入200μL DMSO，在酶标仪上震荡1min，570nm下测定每孔的吸光度。
4)数据处理:
B~F行的值减去本列中G行的值即为每孔MTT的吸光度，每列取平均值,将每列的值除以未加药那列的值即为相应诱导浓度的细胞存活率。
注意事项: .
1)细胞计数方面，一般就我的经验而言，一个长满细胞的培养皿制备成3mL细胞悬液，将此悬液稀释十倍，能得到细胞计数的最佳浓度(每个大格20~100个细胞)。
2)细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及里面的药物会出现浓缩现象，细胞的状况就复朵了，有些人称之为“边缘效应”。
3)对于和MTT有反应的药物来说，可以在加MTT前吸去培养基，再加入MTT。
4)测定时也可以测492nm和630nm下的值，0D492-OD630即为所需要的值。
5)测定的OD值不宜过人，一般在0.8~1.2之间最好，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可能已经超出线性范围。
