一种通用高效的复杂载体构建的新方法

技术与方法

一种通用高效的复杂载体构建的新方法

陆云华

1,2

,马立新,蒋思婧

11

(1.湖北大学生命科学院分子微生物与基因工程实验室,武汉430062;2.宜春学院生物工程系,江西宜春336000)

摘　要:文章报道了一种简便、通用、高效的复杂载体构建方法。此法是在PCR引物设计时,在目的片段5′端加上随机设计的接头,利用PCR克隆目的片段,再用T4DNA聚合酶3′→5′外切酶活性处理PCR克隆目的片段,产生多个首尾相匹配的黏性末端,进行多片段定向连接、转化、重组子鉴定。以7片段拼接的水稻单交换质体定点整合表达载体pRSMGA的构建为例,应用上述方法构建只需做两次连接、转化,且其重组、转化效率高。数10次实验证明:这是一种简便、通用、高效的复杂构建载体的方法,该法至今尚未见报道。关键词:复杂载体构建;新方法;T4DNA聚合酶;水稻中图分类号:Q78　　　文献标识码:A　　　

文章编号:0253-9772(2006)02-0212-07

AUniversalHigh2throughputNovelMethodofConstructingtheVectorsLUYun2Hua

1,2

,MALi2Xin,JIANGSi2Jing

11

(1.LaboratoryofMolecularMicrobiology&GeneEngineering,CollegeofLifeScience,HubeiUniversity,Wuhan430062,China;

2.BiotechnologyDepartmentofYichunUniversity,Yichun,JiangxiProvince33600,China)

Abstract:Inthispaper,asimpleuniversalhigh2throughputmethodofconstructingthevectorswasdeveloped.ItcouldaddproperadapterwhenthePCRprimersweredesigned,andthepurposefragmentswereclonedbyPCR,andthevariouscomplementarystickyendswerecreatedbyT4DNApolymerase’s3′2exodeoxyribonucle2aseactivity.IfallthesefragmentswereputtogetherwithDNAligase,theywouldrecombinateinanorientation.Iftheyhadbeentransformated,thetansformantswouldbeidentified.Let’staketheOryzasativaL.single2crosshomologousrecombinationchloroplastexpressionvectorpRSMGAwhichwasconstructedwithsevenfragmentsasanexample,ifthevectorpRSMGAwasconstructedinusingthemethodwhathadmentioned,on2lytwicerecombinationandtransformationwouldbedone.Scoresofexperimentshadprovedthatitisasimpleuniversalhigh2throughputnovelmethodtoconstructthecomplicatedvectors,whichhasnotappearedinthepe2riodica.l

Keywords:constructingthecomplicatedvectors;novelmethod;T4DNApolymerase;OryzasativaL.

　　载体构建技术是分子生物学和基因工程研究中

[1,2]

的常用技术之一,传统的载体构建方法在构建多片段拼接的复杂的载体时,往往设计、操作较麻烦,通常要构建多个中间载体,需要多次连接、转化,

既费时又费力。本文以7片段拼接的水稻单交换质体定点表达载体pRSMGA(图1)的构建为例,介绍

收稿日期:20050311;修回日期:20050506

基金项目:国家863计划(国家高技术研究发展计划项目)(编号:2002AA227011)和湖北省自然科学基金(编号:2003ABA118)资助项目

[SupportedbyChineseNationalProgramsforHighTechnologyResearchandDevelopment(No.2002AA227011)andNaturalScienceFoundationofHubeiProvince(2003ABA118)]

作者简介:陆云华(1968—),男,博士,副教授,研究方向:分子生物学。Tel:027250865627;E2mail:lyh655@yahoo.com.cn

通讯作者:马立新(1966—),男,博士,教授,博士生导师,研究方向:分子生物学。Tel:862027288666349;E2mail:malixin9@hotmail.com

　2期　　　　　　　　　　　　　陆云华等:一种通用高效的复杂载体构建的新方法213

一种通用、高效的复杂载体构建方法。

图1　质粒载体pRSMGA的结构图

Fig.1　ThestructureoftheVecterpRSMGA

图3　质粒载体VecterpTRcDNA的结构图

Fig.3　ThestructureoftheVecterpTRcDNA

1　材料和方法

1.1　材　料

bA分成man2gfp,aadA,psbA2Prrn3片段,利用3片段

质粒pAMG和pTRcDNA(均为本实验室构建保存),ExTaqPCRCoreKit,T4DNApolyme2rase,dCTP,dGTP(以上试剂均购自TaKaRaBiotechnology(Dalian)Co.Ltd),大肠杆菌(XL2gold)用冷冻法自制超级感受态。1.2　方　法1.2.1　实验方案设计载体pRSMGA中的元件Prrn,man,gfp,aadA,psbA来自载体pAMG(图2),但其排列顺序不同,需要重排;载体pRSMGA中的元件16srRNA,Amp,ori,trnF来自载体pTRcDNA(图3),且其排列顺序也不同,也需要重排。

r

定向连接将其重排,使它们的排列顺序与载体pRSMGA上的一致;再将重排的这5个基因作一个片段克隆下来,与载体pTRcDNA上扩增下来的3个

r

片段16srRNA,Amp2ori,trnF一起作4片段定向连接(图4)。

[3]

图4　质粒pRSMGA的构建图

Fig.4　ConstructedofthevecterpRSMGA

1.2.2　引物设计与合成

图2　质粒载体VecterpAMG的结构图

Fig.2　ThestructureoftheVecterpAMG

对于pRSMGA这个复杂载体的构建,我们设计的实验方案是:先将载体pAMG改造成载体pMGA,即将载体pAMG上的元件Prrn,man,gfp,aadA,ps2

根据pAMG载体上aadA基因的序列设计引

物,在其5′加上接头TATC和GTAC,即aadA53F:5′2TATCggggcagggatggctatatttc23′,aadA55R:5′2GTA2Caagcttacaatatttgccgactacctt23′。

根据pAMG载体上man和gfp基因的序列设计引物,在其5′加上接头TGAC和ATAC,即man2gfpF:5′2TGACccgagggagggatgggggagttg23′,man2

214遗　传HEREDITAS(Beijing)2006　　　　　　　　　　　　　　　　28卷　

gfp50R:5′2ATACatttgtagatggagcttcgatgtc23′。min;72℃,2.5min;共进行35个循环。最后72℃延

根据pAMG载体psbA终止子和prrn启动子上的序列设计引物,在其5′加上接头TACG和TCAG,

即psbA2prrn54F:5′2TACGcgacatcgaagctccatctacaa23′,

psbA2prrn52R:5′2TCAggccataaatccctcccatccaa23′。

伸10min。

质粒pTRcDNA上的Amp2ori片段扩增程序为:

r

94℃预变性5min。94℃,0.5min;54℃,0.5min;72℃,1.8min;共进行35个循环。最后72℃延伸10min。

根据载体pTRcDNA上16SrRNA的序列设计引物,在其5′加上接头TGAC和ATAC,即16SrRNA53F:5′2TGACtggctagaggatttgaaaggc23′,16SrRNA47R:5′2ATACtggaaaaataaatagaaaaagaaatc23′。

质粒pTRcDNA上的trnF片段扩增程序为:

94℃预变性5min。94℃,0.5min;52℃,0.5min;72℃,1.8min;共进行35个循环。最后72℃延伸10min。

根据载体pTRcDNA上Amp2ori的序列设计引

r

物,在其5′加上接头TATC和TTTC,并在其两侧引物接头的内侧加上SacⅡ酶切位点,以便在转化前用SacⅡ将载体pRSMGA线性化,切去Amp和ori,这样对环境更安全友好,其引物为:Amp2ori54F:5′2TATCccgcg2

r

r

质粒pMGA上的Prrn2man2gfp2aadA2psbA片段扩增程序为:94℃预变性5min。94℃,015min;53℃,015min;72℃,315min;共进行35个循环。最

后72℃延伸12min。

1.2.4　目的片段黏性末端的产生gcagctcactcaaaggcggtaat23′,Amp2ori55R:

r5′2TTTC2

ccgcggggggaaatgtgcgcggaa23′。

因为T4DNApolymerase具有3′→5′方向的外切酶活性,可以作用于双链DNA,它能将DNA链上的碱基从3′→5′方向一个个地切下;同时该酶又具有5′→3′聚合酶的活性,在dNTP存在的条件下,表现出聚合酶的活性。因此,我们可以加入一种特定单核苷酸对设定的位置使T4DNApolymerase的外切停止,而产生我们设计的黏性末端。将用dGTP保护碱基,利用T4DNApolymerase3′→5′方向的外切酶活性,处理aadA片段,使之产生能分别与

man2gfp片段、psbA2prrn片断相匹配的末端

[4]

根据载体pTRcDNA上trnF的序列设计引物,在其5′加上接头AAAC和GTAC,即trnF48F:5′2AACgg2

tagatagtaggaacggcacat23′,trnF55R:5′2GTACgcgaagcttac2ccaggggatgt23′。

引物设计后,由上海博亚生物技术有限公司合成。1.2.3　目的片段的PCR克隆体系和条件1.2.3.1　PCR反应体系模板DNA(质粒pAMG、pTRcDNA和pMGA各稀释200倍)加1μL,引物1(10μmol/L)加5μL,引物2(10μmol/L)加5μL,MgCl2(25mmol/L)加5μL,dNTP(25mmol/L)加4μL,10×buffer加5μL,Ex2Taq酶加012μL,补加水到50μL。1.2.3.2　PCR反应程序

;用

dGTP保护碱基,利用T4DNApolymerase3′→5′方

向的外切酶活性,处理man2gfp片段,使之产生能分别与aadA片段、psbA2prrn片断相匹配的末端;用dCTP保护碱基,利用T4DNApolymerase3′→5′方向

质粒pAMG上的aadA片段扩增程序为:94℃预变性5min。94℃,0.5min;54℃,0.5min;72℃,1

min;共进行35个循环。最后72℃延伸7min。质粒pAMG上的man2gfp基因片段扩增程序为:94℃预变性5min。94℃,0.5min;57℃,0.5min;72℃,2min;共进行35个循环。最后72℃延伸7min。

的外切酶活性,处理psbA2prrn片段,使之产生能分

别与aadA片段、man2gfp片段相匹配的末端。(图5)用dCTP保护碱基,利用T4DNApolymerase3′→5′方向的外切酶活性,处理Prrn2man2gfp2aadA2psbA

片段,使之产生能分别与16SrRNA片段、trnF片段相匹配的末端;用dGTP保护碱基,利用T4DNApolymerase3′→5′方向的外切酶活性,处理16SrRNA片段,使之产生能分别与Prrn2man2gfp2aadA2

psbA片段、Amp2ori片段相匹配的末端;用dGTP保

r

质粒pAMG上的psbA2prrn片段扩增程序为:

94℃预变性5min。94℃,0.5min;53℃,0.5min;72℃,3.5min;共进行35个循环。最后72℃延伸12min。

护碱基,利用T4DNApolymerase3′→5′方向的外切酶活性,处理Amp2ori片段,使之产生能分别与16S

r

质粒pTRcDNA上的16SrRNA片段扩增程序为:94℃预变性5min。94℃,0.5min;50℃,0.5

rRNA片段、trnF片段相匹配的末端;用dGTP作保

护碱基,利用T4DNApolymerase3′→5′方向的外切

　2期　　　　　　　　　　　　　陆云华等:一种通用高效的复杂载体构建的新方法215

酶活性,处理trnF片段,使之产生能分别与Amp2ori片段、Prrn2man2gfp2aadA2psbA片段匹配的末端(图6)。

r

大肠杆菌感受态细胞40μL,轻柔混匀,冰浴30min。44℃,热激45s,迅速冰浴2～3min。加入200μLNZY液体培养基,于37℃,250rpm培养1h。取150μL培养物涂布补加了氨卞的LBS平板,37℃倒置培养16h。LBS(固):1%Tryptone,0.5%Yeastextract,1%NaCl,1%魔芋粉,0.02%TrypanBlue.121℃灭菌20min。

2　结　果

2.1　质粒pAMG的目的片段的PCR克隆结果

图5　质粒pMGA的构建图

Fig.5　ConstructedofthevecterpMGA

利用质粒pAMG为模板,分别以aadA,man2gfp,psbA2prrn的引物,按照1.2.3的条件对aadA,man2gfp,psbA2prrn3个片段进行PCR克隆,并克隆到了预计大小的3个片段,即泳道1～3中的片段大小分别为3167kb、1190kb、0185kb(图7).并对它们进行了胶回收和酶切验证。图7　PCR扩增aadA,man2gfp,psbA2prrn片段

Fig.7　AmplificationofaadA,man2gfp,

psbA2prrnfragmentsbyPCR

1.AmplificationofpsbA2prrnfragmentbyPCR;

图6　质粒pRSMGA的构建图

Fig.6　ConstructedofthevecterpRSMGA

2.Amplificationofman2gfpfragmentbyPCR;3.AmplificationofaadAfragmentbyPCR.

1.2.5　目的片段分别磷酸化

[5]

2.2　aadA,man2gfp,psbA2prrn3个片段的处理、连

DNA片段12.0μL,10×buffer2.0μL,ATP5

μL,T4polynucleotidekinase1.0μL,总体积20μL,

在37℃温育1h,溶液回收。1.2.6　目的片段的连接

处理好的片段aadA,man2gfp,psbA2prrn各1μL,弹匀,加solutionⅠ3μL混匀,16℃连接2h后转化;处理好的片段Prrn2man2gfp2aadA2psbA,16S

r

rRNA,Amp2ori和trnF各1μL,弹匀,加solutionⅠ4μL混匀,16℃连接2h后转化。1.2.7　大肠杆菌的常规转化

[6～9]

接与转化结果

　　用T4DNA聚合酶按1.2.4的条件分别对aadA,man2gfp,psbA2prrn3个片段进行消化,产生(图5)相互匹配的黏性末端;再用磷酸激酶按1.2.5的条件分别对aadA,man2gfp,psbA2prrn3个片段进

在1.5mL离心管内加入待转化的DNA3μL,

行磷酸化;将磷酸化处理好的aadA,man2gfp,psbA2prrn片段按1.2.5的条件进行连接;再将连接物常规转化大肠杆菌(XL2Gold),取150μL培养物涂布补加了氨苄青霉素(Amp)和壮观霉素(Spc)的LBS(固)平板,37℃倒置培养16h后,平板上出现60多个带水解圈的菌落(图8)。

216遗　传HEREDITAS(Beijing)2006　　　　　　　　　　　　　　　　28卷　

克隆到了预计大小的3个片段,即泳道1、2、3中的

片断大小分别为21185kb、1180kb、11739kb(图10),并对它们进行了胶回收和酶切验证。利用质粒pMGA为模板,以psbA2prrn的引物,按照11213的条件对Prrn2man2gfp2aadA2psbA片段进行PCR克隆,并克隆到了预计大小的片段,即泳道4中的片断大小为31578kb(图10),并对它们进行了胶回收和酶切验证。

图8　质粒pMGA转化的结果

Fig.8　TansformantsofvecterpMGAontheplate

2.3　3个片段重组质粒pMGA的验证

根据补加了氨苄和壮观霉素的LBS(固)培养

r

皿转化结果判断,转化质粒上含有Amp、aadA、man基因,因为这些大肠杆菌能抗氨苄青霉素、壮观霉素,也能水解魔芋平板,产生明显的水解圈。这分别和3个目的片段aadA,man2gfp,psbA2prrn上含有的基因一致。为了进一步验证转化的质粒是pMGA,而不是质粒pAMG,理论上,以man2gfp片段正向引物(man2gfpF:5′2TGACccgagggagggatgggggagttg2)和aadA片段反向引物(aadA55R:5′3′2GTACaagct2

)做菌落PCR,如果质粒是pM2tacattatttgccgactacctt23′GA,则PCR产物大小应为2175kb,如果质粒是pAMG,则PCR产物大小应为60bp。我们随机挑取

r

图10　PCR克隆16SrRNA、Amp2ori、trnF

和Prrn2man2gfp2aadA2psbA4个片段

Fig.10　Amplificationof16SrRNA,Amp2ori,trnF

r

andpsbA2prrnfragmentsbyPCR

2.5　4个片段的处理、连接与转化结果

用T4DNA聚合酶按11214的条件分别对Prrn2

r

man2gfp2aadA2psbA、16SrRNA、Amp2ori、trnF4个片段进行消化,产生(图6)的相互匹配的黏性末端;再用磷酸激酶按11215的条件分别对上述4个片段进行磷酸化;将磷酸化处理好的片断按11215的条件进行连接;再将连接物常规转化大肠杆菌(XL2Gold),取150μL培养物涂布补加了Amp和Spc的LBS(固)平板,37℃倒置培养16h后,平板上出现多个带水解圈的菌落(图11)。

了10个带水解圈的菌落,做菌落PCR,结果扩出2175kb带(图9),证明转化的是目的质粒pMGA。这也证明这种方法连接转化效率高。

图9　PCR鉴定重组质粒pMGA的结果

Fig.9　Identificationtherecombinants

ofvecterpMGAbyPCR

图11　质粒pMGA转化的结果

2.4　4个目的片段的PCR克隆

Fig.11　TansformantsofvecterpRSMGAontheplate

利用质粒pTRcDNA为模板,分别以16srRNA、

r

Amp2ori、trnF的引物,按照11213的条件对

r

16srRNA、Amp2ori、trnF3个片段进行PCR克隆,并

2.6　重组质粒pRSMGA的连接物的验证

根据补加了Amp和Spc的LBS(固)平板转化

　2期　　　　　　　　　　　　　陆云华等:一种通用高效的复杂载体构建的新方法217

结果判断,转化质粒上含有Amp、aadA、man基因,因为这些大肠杆菌能抗氨苄青霉素、壮观霉素,也能水解魔芋平板,产生明显的水解圈,菌体还发绿光。

r

这分别和Prrn2man2gfp2aadA2psbA、Amp2ori、两个目的片段上含有的4个基因一致。为了进一步验证转化的质粒是pRSMGA,而不是其他质粒,用Prrn2man2

r

gfp2aadA2psbA、16SrRNA、Amp2ori、trnF4个片段的引物做菌落PCR,均得到与以上4个片段大小一致的带(图12),酶切验证也正确。

r

个片断添加上去而造成质粒不稳定的麻烦;而应用以上方法构建此载体,只需连接、转化2次,构建中间载体一个。因此利用这种方法构建复杂载体,不仅可节省了大量时间和试剂,而且使复杂载体的构建变得相对简便。3.2　通用性

应用常规的载体构建方法构建以上7片段拼接的水稻单交换质体定点表达载体pRSMGA,常需要引进7个以上片段上都没有的酶切位点,否则就需要做部分酶切,这给试验设计和操作带来不少麻烦。而利用此法构建以上载体,只在PCR引物设计时,在其5′端加上随机设计引物接头或在目的片段内直接找接头而不需要引入新的碱基,利用PCR克隆目的片段,再用T4DNA聚合酶3′→5′外切酶活性处理PCR克隆目的片段,产生多个首尾相匹配的黏性末端,进行多片段定向连接、转化、重组子鉴定。这样就可以不用寻找合适的酶切位点,也不用引进新的酶切位点,不破坏目的片段的完整性,可省去部分

图12　PCR鉴定重组质粒pRSMGA的结果

Fig.12　Identificationtherecombinantsof

vecterpRSMGAbyPCR1.Amplificationof16srRNAfragmentbyPCR;2.AmplificationofAmpr2orifragmentbyPCR;3.AmplificationoftrnFfragmentbyPCR;4.AmplificationofPrrn2man2gfp2aadA2psbAfragmentbyPCR;5.negativecontro.l

酶切,还可以作定向克隆,这种载体构建方法具通用性,理论上可以用于任何载体的构建,尤其是复杂载体的构建。因此,这是一种值得推广的复杂载体构建的好方法。3.3　高效性

采用这种方法构建复杂载体可以提高了工作效率。因为有些目的片段的PCR克隆、消化和磷酸化可同时进行,这样可以节约大量时间;此外,用T4DNA聚合酶处理片段,产生黏性末端的连接效率比内切酶的高。从理论上分析,T4DNA聚合酶3′→5′外切酶活性在相同的时间内,消化不同片段接头

3　讨　论

实验表明,这是一种简便、通用、高效的复杂载体构建方法,利用此法构建复杂载体的具有以下优点:

3.1　设计操作相对简便

的碱基的能力比较接近,经T4DNA聚合酶处理,产生的多个首尾相匹配的黏性末端,提高了片段之间的连接效率,从而提高了重组、转化效率;而用不同的酶进行双酶切,因其酶切效率不同,会直接影响其连接效率和转化效率。本实验的2.2的质粒pMGA的连接、转化的实验结果直观地验证了以上观点。因为aadA片段上aadA基因的产物可以抗壮观霉素,man2gfp片段上man基因的产物可以水解魔芋粉,gfp基因的产物可以使菌体发绿光,psbA2prrn片段上Amp基因的产物可以抗氨苄青霉素,所以,只有aadA,man2gfp,psbA2prrn这3个片段的连接、转化产物,涂布添加壮观霉素和氨苄青霉素的魔芋平板,才能长出带水解圈菌落(图8)。而在一块平板上长

r

利用以上方法构建简单载体,优势并不是很明显,但构建复杂载体时,此法的优势是显而易见的。常规的载体构建方法在构建多片段拼接的复杂的载体时,往往设计、操作较麻烦,通常要构建多个中间载体,需要多次连接、转化,既费时又费力。而用此法构建复杂载体,可以减少部分中间载体的构建,减少连接、转化次数,大大提高工作效率。如果应用常规的载体构建方法构建以上7片段拼接的水稻单交换质体定点表达载体pRSMGA,需要做6次连接、转化,构建不同的中间载体5个,且不考虑Amp2ori这

r

218遗　传HEREDITAS(Beijing)2006　　　　　　　　　　　　　　　　28卷　

tion).Beijing:SciencePress,2002,153～163.

出60多个3个片段连接、转化的重组子,这种高效

的连接、转化,是用其他方法难以做到的,这也是保

r

证后面Prrn2man2gfp2aadA2psbA、16SrRNA、Amp2ori、trnF4个片段连接、转化成功的基础。

综上所述,这的确是一种简便、通用、高效的复杂载体构建的新方法,我们采用这种方法已成功的构建了复杂载体几十个。参考文献(References):

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中国遗传学会2006年学术活动安排

　　伦理法学和社会问题委员会会议　　　　　时间:2006年3月地点:广东汕头

联系人:哈尔滨医科大学　傅松滨

遗传学教学会时间:2006年8月地点:江西九江或福建武夷山

联系人:广州暨南大学生命科学院　周天鸿微生物遗传会时间:2006年8月地点:湖北武汉

联系人:中国科学院微生物所　谭华荣组学研讨会地点:四川成都

联系人:上海交通大学　贺　林青年学术讨论会地点:福建厦门

时间:2006年10月

时间:2006年11月

联系人:军事医学科学院生物工程研究所　杨　晓