广东药学院学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ￣ａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｆｅｂ．２０１５。３１（１） ＲＰ—ＨＰＬＣ法测定橘红化痰丸中柚皮苷的含量 司徒伟良，陈琳，李海斌，宋粉云 （广东药学院药科学院，广东广州５１０００６） 摘要：目的建立测定橘红化痰丸中柚皮苷含量的方法。方法采用反相高效液相色谱法，色谱柱为 Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ．Ｃ 柱，流动相为甲醇．０．２％（体积分数）Ｈ Ｐ０ 水溶液，梯度洗脱，流速为１．０ ｍＬ・ｍｉｎ一，检测 波长为２８３ ｎｍ，柱温为３０℃。结果柚皮苷质量浓度在５．２ ５２．０ ｇ・ｍＬ 范围内具有良好的线性关 系（ｒ＝０．９９９ ７），柚皮苷平均回收率为１０１．３％，ＲＳＤ值为０．４７％（ｎ＝６）。结论本方法可用于橘红化痰 丸中柚皮苷的质量分数测定。 关键词：橘红化痰丸；柚皮苷；反相高效液相色谱法；含量测定 中图分类号：Ｒ２８４．１文献标志码：Ａ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６—８７８３．２０１５．０１．００９ 文章编号：１００６．８７８３（２０１５）Ｏ１．００４３．０３ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎａｒｉｎｇｉｎ ｉｎ Ｊｕｈｏｎｇ Ｈｕａｔａｎ ｐｉｌｌｓ ｂｙ ＲＰ—ＨＰＬＣ ＳＩＴＵ Ｗｅｉｌｉａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｌｉｎ，ＬＩ Ｈａｉｂｉｎ，ＳＯＮＧ Ｆｅｎｙｕｎ （Ｓｃｈｏｏｌ ｆＰｈａｒｏｍａｃｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｈａｒｎｍ￣ｅｕｔｉｃａｌ Ｕｎｗｅ￣ｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０００６，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｎａｉｒｎｇｉｎ ｉｎ Ｊｕｈｏｎｇ Ｈｕａｔａｎ ｐｉｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎ ＲＰ・ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｃｏｌｕｍｎ ｗａｓ Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ－Ｃ１８．Ｔｈｅ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ｗａｓ ａ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ０．２％ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ ｗｉｔｈ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｔｉｏｎ ａｔ ａ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ １．０ ｍＬ。ｍｉｎ～．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ｓｅｔ ａｔ ２８３ ｎｍ．ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ａｔ ３０℃．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｎａｒｉｎｇｉｎ ｗａｓ ５．２－５２．０ ｇ・ｍＬ （ｒ－－０．９９９ ７）．Ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ １０１．３％，ｗｉｔｈ ＲＳＤ ｏｆ ０．４７％（ｎ ６）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｊｕｈｏｎｇ Ｈｕａｔａｎ ｐｉｌｌｓ；ｎａｒｉｎｇｉｎ；ＲＰ－ＨＰＬＣ；ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ 橘红化痰丸是由化橘红、锦灯笼、川贝母、炒苦 杏仁等８味药材制成的中药成方制剂，具有敛肺化 痰、止咳平喘之功效。临床用于肺气不敛、痰浊内 阻、咳嗽、咯痰、喘促、胸膈满闷等的治疗。橘红化痰 丸的现行标准采用ＨＰＬＣ法测定吗啡的质量分 数［Ｊ＿】。。’。 ，吗啡的测定亦有其他相关报道［ ，但尚 １仪器与试药 Ａｇｉｌｅｎｔ ｌ１００高效液相色谱仪（美捷 司，包括Ａｇｉｌｅｎｔ １１００系列双元泵，Ａｇｉｌｅｎｔ １１００可变 波长检测器，Ａｇｉｌｅｎｔ １ １００化学工作站）；ＳＫ２５１０ＬＨＣ 型高功率数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限 未见制剂中柚皮苷质量分数测定的报道。本文建立 了橘红化痰丸中柚皮苷测定的反相高效液相色谱 公司．工作频率４０ ｋＨｚ，输出功率２５０ ｗ）。 柚皮苷对照品（中国药品生物制品检定所，批 号：１１０７２２．２０１３１２，质量分数以９４．７％计），橘红化 痰丸（天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药 厂，批号：４３６００２４、４３６００２７、４３６００３０，规格９ ｇ・ 法，具有分离效果好、灵敏、准确等优点，可用于橘红 化痰丸的质量控制。 收稿日期：２０１４．０３．２０ 基金项目：广东省自然科学基金资助项目（５００２８４１） 作者简介：司徒伟良，男，本院药学（创新实验班）２０１０级本科生，Ｅｍａｉｌ：１５４６７９０１８１＠ｑｑ．ｃｏｍ；通信作者：宋粉云（１９６５一），女， 教授，硕士生导师，从事现代分析方法在中药质量控制中的应用研究，Ｅｍａｉｌ：ｆｕｈａｉｗｕ＠１６３．ｃｏｒｎ。 网络出版时间：２０１５—０１．１５ １０：４６网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／４４．１４１３．Ｒ．２０１５０１１５．１０４６．００１．ｈｔｍｌ 广东药学院学报 第３１卷 丸 ）。甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为 双蒸水。 ２方法与结果 ２．１ 溶液的制备 ２．１．１ 对照品储备液的制备精密称取柚皮苷对 照品１１．０ ｍｇ，置１００ ｍＬ量瓶中，加７０％（体积分 数，下同）甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得柚皮 苷质量浓度为１０４ ｇ・ｍＬ 的对照品储备液。 ２．１．２供试品溶液的制备取本品大蜜丸，剪碎， 取约０．３ ｇ，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 ７０％甲醇２５ ｍＬ，密塞，称定质量，超声处理１ ｈ，放 冷。再称定质量，用７０％甲醇补足减失的质量。摇 匀，滤过，弃去初滤液，续滤液经Ｏ．４５ ｍ微孔滤膜 滤过，作为供试品溶液。 ２。１．３ 阴性对照溶液的制备取处方组成中除化 橘红外的其余成分制成不含化橘红的阴性对照品， 按“２．１．２”项下的制备方法处理得阴性对照溶液。 ２．２ 色谱条件及系统适应性试验 色谱柱为Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ Ｃ１Ｒ柱（２５０ ａｒｍ￣４．６ ｍｍ，５ ｔｘｓｎ， 迪马公司）；甲醇（Ａ）．Ｏ．２％（体积分数，下同）Ｈ ＰＯ 水溶液（Ｂ）梯度洗脱：０～１９ ｒａｉｎ，４０％Ａ；１９～２１ ｒａｉｎ， １００％Ａ；２１～２５ ｍｉｎ，４０％Ａ；流速为１．０ ｍＬ・ｍｉｎ～； 检测波长为２８３ ｎｌＴｌ；柱温为３０ ｃｃ；进样量为１０ 。 分别精密吸取对照品溶液（柚皮苷质量浓度为 ３１．２ Ｉ．Ｌｇ・ｍＬ ）、供试品溶液和阴性对照溶液１０ Ｌ 注入高效液相色谱仪，按上述条件测定。理论塔板 数以柚皮苷峰计算应不低于６ ５００：柚皮苷峰的拖尾 因子为１．０９，保留时间约为１６．６ ｒａｉｎ，柚皮苷峰与其 他组分峰的分离度大于１．５；阴性样品不干扰测定。 见图１。 ２．３方法学考察 ２．３．１ 标准曲线的绘制 分别精密吸取柚皮苷对 照品储备液０．５、１．０、Ｉ．５、２．０、３．０、４．０、５．０ ｍＬ，分 别加７０％甲醇稀释成柚皮苷质量浓度为５．２、 １０．４、１５．６、２０．８、３１．２、４１．６、５１．２ ｇ・ｍＬ 的对 照品溶液。依次进样１０ Ｌ，按“２．２”项下方法测 定，每个质量浓度测定３次以上。以峰面积（Ａ）对 对照品溶液质量浓度（Ｐ）进行回归，得柚皮苷回归 方程Ａ＝ｌ５．９ｌｐ一０．３５，ｒ＝０．９９９ ７。表明柚皮苷质 量浓度在５．２～５２．０ ｇ・ｍＬ 范围内与峰面积线 性关系良好 １５ ｛ ０ １５ 宝１宣 ０ １５ 薯１０ 鲁 ０ ５ ｌＯ １５ ２Ｏ ２５ ｔ／ｍｉｎ １．柚皮苷。 图１柚皮苷对照品（Ａ）、供试品（Ｂ）及阴性对照（ｃ）溶液 的高效液相色谱图 Ｆｉｇｕｒｅ １ ＨＰＬＣ ｅｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ ｏｆ ｎａｒｉｎｇｉｎ（Ａ），ｓａｍｐｌｅ（Ｂ） ａｎｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ（Ｃ） ２．３．２精密度试验精密吸取质量浓度为３１．２ Ｉｘｇ ・ｍＬ 的柚皮苷对照品溶液ｌ０ Ｌ，按“２．２”项下方 法连续测定５次。结果其峰面积的平均值为 ４９６．９，ＲＳＤ值为１．０４％，表明仪器精密度良好。 ２．３－３稳定性试验取供试品溶液（批号：４３６００３０）， 在０、２、４、６、８、１２ ｈ分别进样１０ Ｌ，按“２．２”项下方 法测定并记录峰面积。结果柚皮苷峰面积的平均值 为４２２．３，ＲＳＤ值为１．４７％，表明供试品溶液在１２ ｈ 内稳定。 ２．３．４重复性试验取同一批（批号：４３６００３０）样 品６份，每份约Ｏ．３ ｇ，精密称定，按“２．１．２”项下方法 制备供试品溶液．按“２．２”项下方法测定，结果柚皮 苷平均质量分数为２．２８５ ｍｇ・ｇ～．ＲＳＤ值为 １．８１％。表明方法重复性良好。 ２．３．５ 加样回收率试验 精密称取同一批（批号： ４３６００３０）样品共６份，加入相应量的柚皮苷对照品， 照“２．１．２”方法处理并测定，计算回收率，结果见表 １。柚皮苷平均回收率为１０１．３％，ＲＳＤ值为０．４７％。 结果表明本方法准确可靠。 ２．４样品测定 取３批样品，各３份，每份约０．３ ｇ，精密称定， 按“２．１．２”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取 对照品溶液（３１．２ ｇ・ｍＬ ）、供试品溶液各１０ ，注入高效液相色谱仪，按“２．２”项下色谱条件测 定。结果批号４３６００３０、４３６００２７、４３６００２４橘红化痰 丸中柚皮苷的质量分数分别为２．２８５、２．３６１、２．４０７ ｍｇ・ｇ一，ＲＳＤ值分别为１．８１％、１．３０％、１．７８％。 第１期 司徒伟良，等．ＲＰ．ＨＰＬＣ法测定橘红化痰丸中柚皮苷的含量 ４５ 表１橘红化痰丸中柚皮苷的回收率试验结果（ｎ－－６） Ｔａｂｌｅ １ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｎａｒｉｎｇｉｎ ｉｎ Ｊｕｈｏｎｇ Ｈｕａｔａｎ ｐｉｌｌｓ ３讨论 化橘红为方中君药，具有理气宽中、燥湿化痰之 功效。黄酮类成分是化橘红的主要有效成分之一． 包括柚皮苷、野漆树苷、枳属苷及新橙皮苷等，其中 柚皮苷占总黄酮质量分数７０％以上，具有抗感染、 镇痛、抗病毒、抗过敏、抑菌及抑制醛糖还原酶等药 理作用［引，是化橘红的主要有效成分之一［ 。为 ２０１０年版《中国药典》一部“化橘红”含量测定项下 指标成分 ｌ Ｊ６９－７ｏ；因此本文选择柚皮苷为测定对象。 试验发现，柚皮苷对照品以甲醇为溶剂时。拖尾 因子为１．２５，而以７０％甲醇溶液为溶剂时拖尾因子 为１．０９。可能对于反相柱，溶解样品的溶剂非极性 太强，容易导致前沿峰的出现，因此以７０％甲醇为 溶剂溶解对照品。 分别采用５０％甲醇溶液、７０％甲醇溶液、甲醇为 溶媒提取样品，结果以７０％甲醇为溶剂时提取率最 高，故选择７０％甲醇作为本试验的提取溶媒。考察 了回流提取法［ ］ 。｝ｌ５ 和超声提取法 ｍ 对柚皮苷 测定的影响，结果回流提取２ ｈ所得样品的柚皮苷 提取率与超声提取６０ ｒａｉｎ相当，但方法相对较繁 琐，所以选择超声提取法制备供试品。分别考察超 声处理３０、４５、６０、７０ ｍｉｎ对橘红化痰丸中柚皮苷测 定的影响，结果提取６０ ｍｉｎ时柚皮苷提取率最高， 所以确定超声法提取６０ ｍｉｎ 柚皮苷为双氢黄酮类化合物，结构中有酚羟基， 因此ＨＰＬＣ测定质量分数采用离子抑制色谱法。文 献报道的流动相体系有甲醇．醋酸．水 ］６％７０，［ ］、甲 醇．Ｈ ＰＯ 水溶液 、乙腈．Ｈ ＰＯ 水溶液［引，本文 以甲醇．０．８％（体积分数）醋酸溶液（体积比３５： ６５）、甲醇．０．１％（体积分数）Ｈ ＰＯ 溶液（体积比３８ ：６２）为流动相进行考察，柚皮苷出峰时间约为３Ｏ ｍｉｎ，但峰形对称度不好，拖尾因子不符合要求；以甲 醇．０．１％（体积分数）Ｈ ＰＯ 溶液（体积比４０：６０）为 流动相，出峰时间提前到１６．４ ｍｉｎ。但峰形对称度不 好；改用甲醇．０．２％（体积分数）Ｈ ＰＯ 溶液（体积比 ４０：６０）为流动相，柚皮苷约ｌ６．６ ｍｉｎ出峰，峰形较 好。采用等度洗脱，整个样品分析时间较长（约５０ ｍｉｎ），改用梯度洗脱，大大缩短了分析时间。 参考文献： ［１］国家药典委员会．中华人民共和国药典：２０１０年版一部 ［Ｍ］．北京：中国医药科技出版社，２０１０． ［２］戴敬，冯丽，孙明，等．ＨＰＬＣ法测定橘红化痰丸中吗啡的 含量［Ｊ］．药物分析杂志，２００８，２８（１０）：１７５７．１７５９． ［３］朱海扬，曾慧兰．黄酮类化合物药理作用的研究进展 ［Ｊ］．山东医药，２００９，４９（１７）：１１４，１１５． ［４］黄兰珍，梁照恒，林励，等．不同炮制方法对化橘红中柚 皮苷含量的影响［Ｊ］．中药新药与临床药理，２００５，１６ （１）：５９—６１． ［５］文小燕，谭梅英，张诚光．不同产地化橘红中柚皮苷的含 量分析［Ｊ］．湖南中医杂志，２０１３，２９（６）：１２５—１２６． ［７］李吉华．化橘红中柚皮苷、柚皮芸香苷、野漆树苷和柚皮 素的ＨＰＬＣ测定［Ｊ］．山东中医杂志，２０１２，３１（４）：２７７— ２７８． ［８］刘群娣，徐新军，谢春燕，等．２０１０年版《中国药典》化橘 红含量测定方法的商榷［Ｊ］．中国药品标准，２０１１，１２ （６）：４４２－４４４． ［９］谢强胜，王坤，尹宁宁．ＲＰ．ＨＰＬＣ法测定橘红丸中甘草 苷、柚皮苷、橙皮苷和迷迭香酸［Ｊ］．中成药，２０１１，３３ （１２）：２０８５—２０８７． ［１０］张伟，林彤，江英桥．ＲＲＬＣ法同时测定橘红痰咳颗粒中 苦杏仁苷和柚皮苷［Ｊ］．中成药，２０１２，３４（５）：８６５—８６８． （责任编辑：刘晓涵）
