现代泌尿生殖肿瘤杂志２０１３年１Ｏ月第５卷第５期ｏｂｅｒ ２０１３，Ｖｏｌ ５，Ｎｏ．５ Ｒｅｐｒｏｄ Ｏｎｃｏｌ，ＯｃｔＪ Ｃｏｎｔｅｍｐ Ｕｒｏｌ——实验研究 Ｋｕ８ ０基因ＲＮＡｉ逆转录病毒载体的构建及稳定转染 人肾癌７ ８ ６一Ｏ细胞株的建立 戚德峰 胡渊 曾国华 纪卫东 ｄｏｉ：１０．３８７０／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４—４６２４．２０１３．０５．０１１ 【摘要】 目的 构建并鉴定逆转录病毒介导的Ｋｕ８０基因ＲＮＡ干扰表达体系，并建立稳定、高 效、长久低表达ＫｕＳ０的人肾癌７８６一Ｏ细胞株。 方法 针对Ｋｕ８０基因，设计并合成３对特异性 ＲＮＡ干扰靶序列，退火形成双链ＤＮＡ，与Ｂｇｌ １和Ｈｉｎｄ Ｉｌｌ双酶切后的ｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏ—ｐｕｒｏ载体连 接，构建ｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏ－ｐｕｒｏ－ｓｉＫｕＳ０干扰表达载体，并对重组载体进行测序鉴定。筛选出基因沉默效 应最强的干扰序列后使用磷酸钙法共转染２９３ＦＴ细胞，产生的病毒颗粒随后感染７８６一Ｏ细胞，经嘌呤 霉素筛选得到阳性克隆。用ＲＴ—ＰＣＲ检测ＫｕＳ０基因ｍＲＮＡ表达，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ测定转染后７８６一Ｏ 细胞中Ｋｕ８Ｏ蛋白的表达量，以鉴定稳定细胞株。 结果 测序结果证实目的片断正确插入 ｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏ—Ｐｕｒｏ表达载体中，成功构建了ｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏ—ｐｕｒｏ—ｓｉＫｕ８０干扰表达载体，稳定转染干 扰表达载体的７８６一Ｏ细胞ＫｕＳ０基因的表达显著降低。 结论 成功构建了抑制Ｋｕ８０基因表达 的逆转录病毒载体，并获得Ｋｕ基因稳定干扰的人肾癌７８６一Ｏ细胞株，为下一步利用小干扰ＲＮＡ技 术研究肾癌的基因治疗奠定了基础。 【关键词】Ｋｕ８０； 逆转录病毒载体； ＲＮＡ干扰； 肾肿瘤 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ＫｕＳ０ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ７８６一Ｏ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＱＩ ＤＰ— ｎｇ，ＨＵ Ｙｕａｎ，ＺＥＮＧ Ｇｕｏ—ｈｕａ， Ｈ Ｗｅｉ—ｄｏｎｇ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ Ｉｎｖａｓｉｏｎ Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｃｅｎｔｅｒ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ａ历ｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５ｊ０２３０，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｊ Ｗｅｉ—ｄｏｎｇ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｄｊｉ＠ｇｚｈｍｃ．ｅｄｕ．ｅｎ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｋｕ８Ｏ ｇｅｎｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ．ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ７８６一Ｏ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｓｔａｂｌｅ， ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍ ｌｏｗ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＫｕＳ０． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｗｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｔｈｒｅｅ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ＫｕＳ０ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ａｎｎｅａｌｅｄ ｔｏ ｆｏｒｍ ｄｏｕｂｌｅ—ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ａｎｄ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｔｏ ｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏ—ｐｕｒｏ ｖｅｃｔｏｒｓ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｂｇｌ １Ｉ ａｎｄ ＨｉｎｄⅢ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｃａｌｌｅｄ ｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏ—ｐｕｒｏ—ＫｕＳ０ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅ ｉｎ— ｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＫｕＳ０ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｃｏ——ｔｒａｎｓ—— ｆｅｃｔｅｄ ｉｎ ２９３ＦＴ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ．Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ７８６一Ｏ ｃｅｌｌｓ，ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｄｅｎ— ｔｉｆｖ ｔｈｅ ｓｔａｂｌｅ ｃｅｌｌｌｉｎｅ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ １ｅｖｅｌｏｆ Ｋｕ８０ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂｏｔｈ ｍＲＮＡ １ｅｖｅｌ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌ ｂｙ ＲＴ—ＰＣＲ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔａｒ— ｇｅｔ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ ｉｎｔｏ ｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏ—ｐｕｒｏ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｗｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏ—ｐｕｒｏ—ｓｉＫｕＳ０ ｖｅｃｔｏｒｓ．ＲＴ—ＰＣＲ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，７８６一Ｏ ｃｅｌｌｓ ｓｔａｂｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｖｅｃｔｏｒ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ Ｋｕ８０ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ｗｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｋｕ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｓｔａｂｌｅ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ７８６一Ｏ ｃｅｌｌｌｉｎｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＫｕＳ０ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｋｉｄｎｅｙ ｃａｎｃｅｒ ｂｙ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ． 基金项目：国家自然科学基金面上项目（８１２７１３５０）；广东省自然科学基金面上项目（￥２０１２０１０００８９０８）；广州市属高校羊城学者学术带 头人项目（１２Ａ０１５Ｇ） 作者单位：５１０２３０广州医科大学附属第一医院微创外科中心泌尿外科广东省泌尿外科重点实验室 通讯作者：纪卫东，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｄｊｉ＠ｇｚｈｍｃ．ｅｄｕ．ｃｎ 塑垦生堕 盘声２０１３年１ｏ月第５卷第５期Ｊ Ｃｏｎｔｅｍｐ Ｕｒｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｏｎｃｏｌ，Ｏｃｒｏｂｅｒ ２０１３，Ｖｏ１ ５，Ｎｏ．５ ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］Ｋｕ８０； Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ； ＲＮＡ ｉｎｔｅＨｅｒｅｎｃｅ； Ｋｉｄｎｅｙ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ Ｋｕ蛋白是由７０ ｋＤ和８０ ｋＤ两条多肽链组成， 续研究打下基础。 分别被称为Ｋｕ７０和Ｋｕ８０。Ｋｕ７０亚单位由６０９个氨 基酸组成，分子量约６９ ５８１ Ｄａ，Ｋｕ８０包括７３２个氨 材料与方法 基酸，分子量约８１ ９１４ Ｄａ。尽管两亚基有不同的生 一、主要材料和试剂 化特性，但是它们很可能起源于同一个基因，在酵母 人肾癌７８６一Ｏ细胞株、ｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏ—ｐｕｒｏ载 中对Ｋｕ７０与Ｋｕ８０两亚基比较研究发现，位于两亚 体及大肠杆菌ＤＨ５ａ、ＳＴＢＬ３感受态细胞均由本实 基Ｃ端的氨基酸中２２ 是相同的，３８ 是相似的［１］。 验室保存。Ｂｇｌ １１和Ｈｉｎｄ ＩＩＩ酶购自Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ 研究表明，Ｋｕ蛋白与ＤＮＡ双链断裂修复密 Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）公司。琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒 切相关，其机制是Ｋｕ７０和Ｋｕ８０两亚基紧密结合形 购自北京天根公司。质粒抽提试剂盒购自Ｑｉａｇｅｎ 成的异源二聚体结构与ＤＮＡ依赖蛋白激酶（ＤＮＡ— 公司。嘌呤霉素购自Ｓｉｇｍａ公司。转染试剂Ｌｉｐｏ— ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ，ＤＮＡ—ＰＫ）催化亚单位 ｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００、Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。 ＤＮＡ—ＰＫＣｓ结合形成的ＤＮＡ—ＰＫ，在体内参与 １６４０培养液和胎牛血清购自Ｇｉｂｃｏ公司。Ｔ４ＤＮＡ ＤＮＡ双链断端的修复＿２。］，此外，Ｋｕ蛋白还参与多 连接酶、逆转录试剂盒、聚合酶链式反应（ＰＣＲ）试剂 种生物学功能，如生长抑制、细胞增殖、细胞周期调 盒及ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ荧光染料购自ＴａＫａＲａ公司。寡 控、端粒维持、转录调节、凋亡和病毒感染等，这表明 核苷酸序列由捷瑞公司合成。 Ｋｕ基因是细胞内多功能的看家基因［４］。由于目前 二、方法 对Ｋｕ基因在肾癌的发生、发展及治疗前景方面了 １．Ｋｕ８０一ｓｉＲＮＡ靶序列的选择：根据ＧｅｎＢａｎｋ 解甚少，本实验选择其中的ＫｕＳ０基因作为沉默的 中基因（ＮＭ０２１１４１）信息，采用干扰序列设计软件 对象，构建了Ｋｕ８０基因ＲＮＡｉ逆转录病毒载体，并 针对Ｋｕ８０设计３条ｓｉＲＮＡ靶序列和一条对照序 建立了能够稳定低表达Ｋｕ８０的肾癌细胞株，为后 列。设计引物及序列见表１。 表１设计引物及序列 引物 ｓｉ—Ｋｕ８０一Ｆ１ ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＴＧＧＣＣＡＴＡＧＴＴＣＧＡＴＡＴＧＣＴＴＣＡ ＡＧＡＧＡＧＣＡＴＡＴＣＧＡＡＣＴＡＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＴＴＴＡ ｓｉ—Ｋｕ８０一Ｒ１ ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＧＧＴＧＧＣＣＡＴＡＧＴＴＣＧＡＴＡＴＧＣＴ ＣＴＣＴＴＧＡＡＧＣＡＴＡＴＣＧＡＡＣＴＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＧ ｓｉ—Ｋｕ８０一Ｆ２ ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＡＣＡＧＴＴＧＡＡＴＧＣＴＧＴＴＧＡＴＴＣＡ ＡＧＡＧＡＴＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＴＡ ｓｉ—Ｋｕ８０一Ｒ２ ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＴＧＡＡＴＧＣＴＧＴＴＧＡＴ ＣＴＣＴＴＧＡＡＴＣＡＡＣＡＧＣＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＣＣＧＧＧ ｓｉ—Ｋｕ８０一Ｆ３ ＧＡＴＣＣＣＣＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＡＧＣＧＡＧＴＡＡＣＣＴＴＣＡ ＡＧＡＧＡＧＧＴＴＡＣＴＣＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＴＡ ｓｉ—Ｋｕ８０一Ｒ３ ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＡＧＧＡＡＧＣＧＡＧＴＡＡＣＣＴ ＣＴＣＴＴＧＡＡＧＧＴＴＡＣＴＣＧＣＴＴＣＣＴＣＡＡＡＧＣＧＧＧ ｓｉ—ＫＵ—Ｃｏｎ—Ｆ ＧＡＴＣＣＣＣＧＣＣＡＧＣＴＴＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴＴＣＡ ＡＧＡＧＡＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＡＡＧＣＴＧＧＣＴＴＴＴＴＡ ｓｉ—ＫＵ—Ｃｏｎ－Ｒ ＡＧＣＴＴＡＡＡＡＡＧＣＣＡＧＣＴＴＡＧＣＡＣＴＧＡＣＴＣＴ ＣＴＣＴＴＧＡＡＧＡＧＴＣＡＧＴＧＣＴＡＡＧＣＴＧＧＣＧＧＧ ２．重组质粒载体的构建及鉴定：将合成好的脱 培养。取６×１０ 对数期细胞接种到六孔板培养，将 氧核苷酸稀释为１ Ｆｇ／￣ｌ，取相应的Ｆ与Ｒ链各５ １ 其分组为：①ｓｉＣｏｎ（阴性对照序列）；②ｓｉＫｕ８０—１；③ 退火形成双链，用Ｂｇｌ ＩＩ和Ｈｉｎｄ ＩＩＩ双酶切ｓｉＲＮＡ ｓｉＫｕ８０—２；④ｓｉＫｕ８０—３。待细胞贴壁生长达７Ｏ％～ 表达载体ｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏ—ｐｕｒｏ，胶回收酶切后的 ８０ 融合时，将相应的干扰质粒及阴性对照质粒各 ｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏ—ｐｕｒｏ，连接退火形成的ＤＮＡ双链与 ４ ｇ经Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００转染到７８６一Ｏ细胞中， 双酶切的空载体，将连接产物转入制备好的大肠杆 ４８ ｈ后收集细胞使用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测干扰效率， 菌感受态细胞ＳＴＢＬ３，挑取阳性克隆送华大基因公 选取沉默效应最强的干扰序列用于后续研究。 司测序鉴定。将重组质粒载体分别命名为ｐＳＵ— ４．逆转录病毒载体的构建：将筛选出的干扰质 ＰＥＲｒｅｔｒｏ—ｐｕｒｏ—ｓｉＫｕ８０和ｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏ—ｐｕｒｏ—ｃｏｎ— 粒及对照质粒分别与２０ Ｆｇ ＰＩＫ（包装质粒）混合， ｔｒｏｌ。 再加入５Ｏ １ ＣａＣ１２，１１０ １ Ｈ２ Ｏ混匀，滴加２００ ｌ ３．干扰序列的筛选：肾癌７８６一Ｏ细胞用含１０％ ＨＢＳ溶液至混合液中，温室静置３０ ｍｉｎ；３７℃温箱取 胎牛血清的１６４０培养液于３７℃、５ ＣＯ：条件下 出２９３ＦＴ细胞，把混合好的待转染液体轻轻均匀滴 现代泌尿生殖肿瘤杂志２０１３年１Ｏ月第５卷第５期Ｊ Ｃｏｎｔｅｍｐ Ｕｒｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｏｎｃｏｌ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１３，Ｖｏｌ ５，Ｎｏ．５ 讨 论 近年来，与ＤＮＡ双链断裂修复密切相关的Ｋｕ 蛋白在肿瘤发生、发展、诊断和治疗及预后等研究中 越来越受重视。Ｋｕ８０作为Ｋｕ７０／Ｋｕ８０异源二聚 体的一个组成单位，它的缺失和活性改变与肿瘤的 发生、发展及治疗密切相关。有研究已提出Ｋｕ８０ 的表达与肿瘤的恶性程度呈正相关，与预后呈负相 关ｌ５］。另外，还有许多研究表明Ｋｕ８０缺乏的细胞 其电离辐射或化学治疗敏感性增高 ］。因此，对于 Ｋｕ８０的研究，有助于了解癌症的发病机制以及治 疗方式。本实验构建了稳定低表达Ｋｕ８０基因的肾 癌细胞，为后续的肾癌治疗研究打下了基础。 ＲＮＡｉ是近年来的重大科技发现，其基本原理 是通过一类ｓｉＲＮＡ高效特异地阻断特异基因的表 达，使同源１ＴＩＲＮＡ发生降解，从而使该基因表达沉 默。ＲＮＡｉ技术是通过在细胞内转染与靶基因相同 序列的双链ＲＮＡ，达到靶基因沉默效应的一种新兴 基因阻断技术。由于其具有特异性强、抑制效率高， 操作简易等特点，因而已经成为研究哺乳动物基因 功能、细胞信号传导、细胞分化、发病机制和基因治 疗的重要工具。为了保证ｓｉＲＮＡ序列的有效性，我 们针对Ｋｕ８０设计并合成了３条ｓｉＲＮＡ靶序列，并 且构建了ｓｉＲＮＡ表达载体，经过瞬时转染技术筛选 出一条沉默作用最强的干扰序列用于实验。 目的基因导人载体的选择是获得长期稳定表达 细胞株的关键环节。目前，目的基因常用的导入载 体主要是病毒载体和质粒真核载体。质粒介导 ＲＮＡｉ有一定的局限性，其转染率低，基因抑制表达 作用弱，持续时间短，不适合体内实验＿１ 。与质粒 载体相比，病毒载体具有转移率高、可以长期稳定的 基因表达及适用范围广等优点，因而越来越受研究 人员的青睐。其中，逆转录病毒载体可将目的基因 有效地整合到宿主细胞基因组中，稳定介导目的基 因的表达，是目前基础和临床应用研究中使用最广 泛的一类载体。本研究运用磷酸钙法转染ＰＩＫ（包 装质粒）与重组质粒载体于２９３ ＦＴ包装细胞产生 逆转录病毒，感染７８６—０细胞后使用ｐｏｌｙｂｒａｎｅ筛 选出稳定转染的细胞株。ＲＴ—ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 结果表明，逆转录病毒介导的ＲＮＡｉ具有很强的基 因沉默效应，７８６—０一ｓｉＫｕ８０细胞株中Ｋｕ８０ ｍＲＮＡ 的表达量为对照组的３７．９ ，Ｋｕ８０蛋白的表达量 较对照组明显降低。 综上所述，本研究成功构建了Ｋｕ８０基因ＲＮＡｉ 逆转录病毒载体，并建立了其稳定转染的人肾癌 ７８６—０细胞株，为下一步利用ｓｉＲＮＡ技术研究肾癌 的基因治疗奠定了基础。 参 考 文 献 Ｆｅａｔｈｅｒｓｔｏｎｅ Ｃ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＳＰ．Ｋｕ，ａ ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｍｕｌ— ｔｉｐｌｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ？ＥＪ］．Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ，１９９９，４３４（１）：３－１５． 金儿，任振义，卢忠，等．ｘ线照射后Ａ５４９肺癌细胞Ｋｕ８０ ｍＲＮＡ 及其蛋白表达的变化［Ｊ］．中华放射医学与防护杂志，２００９，２９ （４）：３９３－３９５． Ｓｉｂａｎｄａ ＢＬ，Ｃｈｉｒｇａｄｚｅ ＤＹ，Ｂｌｕｎｄｅｌｌ ＴＬ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＤＮＡ— ＰＫｃｓ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｌａｒｇｅ ｏｐｅｎ—－ｒｉｎｇ ｃｒａｄｌｅ ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ ＨＥＡＴ ｒｅｐｅａｔｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１０。４６３（７２７７）：１１８—１２１． Ｂｌａｄｅｎ ＣＬ，Ｎａｖａｒｒｅ Ｓ，Ｄｙｎａｎ ＷＳ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｋｕ７０ ｓｕｈｕｎｉｔ（ＸＲＣＣ６）ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｌＯＷ ｄｏｓｅ ｉｏｎｉ— ｚｉｎｇ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，２００７，４２２（２）：９７－１Ｏ２． Ｄｉｆｉｌｉｐｐａｎｔｏｎｉｏ ＭＪ，Ｚｈｕ Ｊ，Ｃｈｅｎ ＨＴ，ｅｔ ａ１．ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｕ８０ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｒａｎｓ— ｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０４（６７７７）：５１０—５１４． Ｋｏｉｋｅ Ｍ，Ｋｏｉｋｅ Ａ．Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｕ８０ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｔ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ—ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２００８， ３１４（５）：１０６１－１０７０． Ｒｏｂｅｒｔ ＲＡ，Ｒａｍｓｄｅｎ ＤＡ．Ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，Ｋｕ。ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｏｃｃｌｕｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｓ［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００７，２８２（１４）：１０６０５—１０６１３． Ｍａｔｈｅｏｓ Ｄ。Ｎｏｖａｃ Ｏ，Ｐｒｉｃｅ ＧＢ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｘｒｓ一５ ｍｕｔａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｋｕ８６［Ｊ］．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，２００３，ｌ１６（Ｐｔ １）：１１卜１２４． Ｓｈａｏ ＣＪ，Ｆｕ Ｊ，Ｓｈｉ ＨＬ，ｅｔ ａ１．Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＤＮＡ—ＰＫ ａｎｄ Ｋｕ８６，ｂｕｔ ｎｏｔＫｕ７０，ｍａｙ ｐｒｅｄｉｃｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｍａｓ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ，２００８，８９（１）：２７—３５． Ｊａｚａｇ Ａ，Ｉｊｉｃｈｉ Ｈ，Ｋａｎａｉ Ｆ。ｅｔ ａ１．Ｓｍａｄ４ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｐａｎｃｒｅ— ａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｓｔａｂｌｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ．．ｂｅ．． ｔａ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００５。２４（４）：６６２—６７１． （收稿日期：２０１３～０８—２２） （本文编辑：徐汉玲）
