ELISA法检测乙肝五项的影响因素及临床应用
【摘要】众所周知，乙肝的致病原是乙肝病毒，乙肝病毒在肝细胞内生存、复制后，再排出到血液中。所以不仅血流中病毒高负荷，而且肝脏的大多数肝细胞都被感染。当今社会谈乙肝色变，主要有下列几个方面：长期病毒携带或患病怕传染给亲属和周边的人群，同时亦担心受到社会的歧视；治疗乙肝和各种护肝药名目繁多，且各有利弊而不知所从；长期病毒携带或久治不愈而演化成肝硬化甚至肝癌。作为检测乙肝五项的工 作人员应该慎重操作，对每一个结果负责，不能因假阳性引起患者的心理压力和精神痛苦，造成不必要的纠纷。
【 关键词】ELISA法；乙肝两对半；
乙肝两对半又称乙肝五项 ，为国内常用的乙肝病毒(HBV)感染的检测血清标志物。乙肝病毒免疫学标记有表面抗原(HBsAg)、表面抗体(抗-HBs或HBsAb)、e抗原(HBeA g)和e抗体(抗-HBe或HBeAb)、核心抗原(HBcAg)和核心抗体(抗-HBc或HBcAb)”。可检测患者是否感染乙肝及感染的具体情况。随着现代临床免疫学的发展，酶联免疫吸附试验(ELISA) 因其操作简单、灵敏度高、特异性高等特点而广泛应用于乙肝五项的检测。但由于乙肝标志物检测生产试剂厂家较多，各种试剂诊断灵敏度及特异性相差很大，因此，如何选择灵敏度高、特异性好的乙肝标志物检测试剂成为乙肝检测中至关重要的问题之一。本研究分别选择 3家国产ELISA试剂盒对来甘肃省武威肿瘤医院参加健康体检患者血液样品进行乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)检测，乙肝表面抗原(HBsAg)检测试剂盒，通过ELISA法检测300例健康体检患者血清中HBsAg水平，检测出的阳性标本再用免疫胶体金试纸条检测 ，比较三个不同公司生产试剂盒检测阳性率及与金标试纸条法检测的一致性，现报道如下 ： 1资料与方法
1 ． 1一般资料
选择我院2013年7月——2 013年11月健康体检患者300例，其中，男170例，女130例；年龄20～54岁，平均30岁。抽取患者静脉血，分离血清，低温(2~8℃)保存待检。
1．2方法
1．2．1检测试剂盒分别购自上海江莱生物科技有限公司(简称江莱)，北京万泰生物药业股份有限公司(简称万泰)、英科新创(厦门)科技有限公司(简称新创)。其中包括96孔(48人份)酶标板，阴性对照1mL，阳性对照1 mL，酶结合物6mL，显色剂A6mL，显色剂B6mL， 20倍洗涤液40mL，终止液6mL，说明书1份，不干胶3张，自封袋1个。抗HBV金标试纸条购自新创。
1．2．2检测仪器振荡器(型号ZD一8800)。购自上海精密仪器仪表有限公司，酶标仪购自郑州安图生物工程有限公司，型号：Anthos2010。
1．2．3检测方法采用ELISA法检测。严格按照试剂盒操作步骤进行，即：①使用前， 充分混匀所有试剂，勿产生泡沫。②根据待测样品数量确定所需酶标板数量。每次实验设空 白对照孔1孔。阴性对照、阳性对照各2孔。待检标本用稀释液1：1稀释后加入50L于酶标板反应孔内。采用棋盘法做倍比稀释．使标本浓度依次为40、20、10、5．0、2．5、1．2 5、IU／L。同样方法稀释阴性血清。③加人稀释好后的标准品及阴性血清50L于反应孔，待测样品50L于反应孔内，立即加入50L的生物素标记的抗体。盖上膜板．轻轻振荡混匀，37℃孵育1h。④甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30S，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作5次。⑤每孔加入80L的亲和链酶素一HRP， 轻轻振荡混匀，37℃孵育30m i n。⑥每孔加入底物A、B各50L，轻轻振荡混匀，37℃温育10min。避免光照射。⑧取出酶标板，迅速加入50L终止液，加入终止液后应立即测定结果。⑨在450nm波长处测定各孔的OD值。分别用3个不同公司的试剂盒进行初测，初测ELISA阳性标本再采用胶体金法测定
1次。金标试纸条于检测线及对照线位置处各出现一条紫红色线条为阳性，只于对照线位置 出现l条紫红色线条为阴性。未出现任何线条表示金标试纸条失效。
1．3结果判定及观察项目
测定孔OD值／阴性对照孔OD值(S／N)大于2．1判为阳性。比较3个不同公司 ELISA检测灵敏度、特异性及与胶体金法检测的一致性
2结果
江莱、万泰、新创三家厂家生产的试剂盒检测 HB s A g阳性率分别为13％(39／300)、10％(30／300)、20％(60／300)。新创阳性性率最高。阳性血清经金标试纸条检测阳性结果分别为30、23、42例。新创试剂盒ELISA法检测抗原包被浓度为1．25IU／L时，仍可检出阳性标本。其他两个试剂盒最低检出浓度为2．5IU／L。
3. 结论:
不同厂家 ELISA试剂盒检测结果存在差异 ， 临床检测时需综合几个试剂盒结果及其他试验进行印证。
4.讨论：
慢性乙型肝炎为世界性医学难题之一，为世界范围内引起慢性肝脏疾病的主要病原之一，起病缓慢，感染率高，我国为HBV感染的主要流行病区，截至2011年有慢性HBV携带者约1．2亿，慢性乙型肝炎患者约3000万例，以每年新增病例l0万～25万的速度增长。大多数患者无明显症状并可导致肝硬化、肝癌等终末期肝病，目前尚无治疗特效药。主要通过血液、母婴及性接触传播。乙肝疫苗为控制及预防乙型肝炎的主要措施。HBsAg血清中HBsAg阳性是HBV感染的标志，本身有抗原性，无传染性，但由于HBsAg常与HBV同时存在，通常认为是传染性标志之一。HBV标志物检测是临床诊断乙肝感染的重要依据，也是抗病毒治疗检测的重要指标之一。临床通常采用免疫学检测及核算检测两类方法进行。基于免疫学检测的酶联免疫吸附试验因操作方便、灵敏度高、特异性好而较多用于乙肝患者的初筛。胶体金是由氯金酸(HAuC)在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，与静电作用形成一种稳定的胶体状态，在弱碱性环境下可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固结合， 这种结合为静电结合，不影响蛋白质的生物学性质。单克隆抗体包被于检测线处，抗金标抗体包被于对照线处，金标抗体吸附于固相载体无纺纱上。利用抗原抗体特异性结合的免疫反应原理，在检测线处形成抗体-待测抗原-金标抗体复合物，在对照线处形成抗金标抗体-金标抗体复合物。具有特异性强、灵敏度高、使用方便等优点。但常因判断结果时间不够、反应不充分、温度低、样本加样问题、过滤膜破损等原因导致判断失误，也可因临床医师经验不足把隐约可见的阳性线误判为阴性等不正常结果发生。
酶联免疫吸附试验检测 HBV抗体为较简便、快速的检测方法。临床检测通常检测HBsAg及HBsAb。HBsAg为病毒外膜蛋白的重要组成成分，为HBV感染的最主要的血清 学检测指标。HBsAg阳性提示HBV现症感染，阳性持续时间超过6个月则为慢性HBV感染。目前国内HBsAg检测使用的ELISA法多为定性检测，只能初步判断阴性或者阳性，也有半定量检测的ELISA试剂盒，通常以信号／临界值(singal／cut—off．S／CO)或临界指数表示。目前国产HBsAg ELISA试剂盒灵敏度在0．2～0．5IU／mL之间。HBV9种不同血清型aywl、ayw2、zyw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq、adwq，分别位于HB-sag第2、3跨膜区亲水区的a表位为各血清型病毒共有的免疫优势表位。正是由于不同血清型a位氨基酸组成的差异，导致同一试剂对不同血清型病毒检测能力存在差异。本组研究中新创公司生产的ELISA试剂盒灵敏度略高于其他两个公司，差异无统计学意义 ( P>0．05)。不同厂家生产的ELISA试剂盒检测HBsAg结果存在不一致性．可能与厂家用于检测时包被的乙肝病毒基因片段不一致有关。本组实验结果表明，不同厂家ELISA试剂盒检测结果存在差异，临床检测时需综合几个试剂盒结果及其他试验进行验证。
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