实验四 麦芽糖化力的测定
一、实验目的
1、掌握麦芽糖化力的定义；
2、掌握碘量法测定还原糖的原理和方法。
二、实验原理
麦芽浸出液中存在多种酶，其中能够水解淀粉质多糖的糖苷键形成低聚糖和单糖等产物的一类酶统称为淀粉酶（α-淀粉酶，β-淀粉酶）。糖化力是指所有淀粉酶水解淀粉成为单糖或双糖的能力。淀粉酶水解淀粉生成含有自由醛基的单糖或双糖，醛糖在碱性碘液中定量氧化为相应的羧酸。剩余的碘，酸化后以淀粉作指示剂，用标准的Na2S2O3溶液滴定。主要反应如下：
1、淀粉在麦芽浸出液中的淀粉酶的作用下，水解成含有醛基的单糖或双糖；
(C6H10O5)n+nH2O 淀粉酶 nC6H12O6
2、醛糖在碱性碘液中定量氧化为相应的羧酸；
I2+2NaOH NaIO+NaI+H2O
CH2OH(CHOH)4CHO+ NaIO CH2OH(CHOH)4COOH+ NaI
3、过量未作用的NaIO在碱性条件下发生歧化反应；
3NaIO NaIO3+2NaI
4、加入酸，使NaIO3和NaI在酸性条件下发生氧化还原反应，析出过量的碘；
NaIO3+ 5NaI+3H2SO4 3I2+3Na2SO4+ 3H2O
5、析出的碘以淀粉为指示剂，用Na2S2O3标准溶液滴定。
2Na2S2O3+ I2 Na2S4O6+ 2NaI
三、实验材料与试剂
1、样品
可溶性淀粉；麦芽粉 2、器材
电子天平（0.1mg）；电热恒温水浴锅；容量瓶；酸碱滴定装置。 3、试剂
乙酸钠；冰乙酸；硫代硫酸钠；碳酸钠；重铬酸钾；碘化钾；可溶性淀粉；
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碘液；氢氧化钠；硫酸。
2%可溶性淀粉溶液：称取预先在100-105℃干燥的可溶性淀粉10.000g，加入少量水调成糊状，在不断搅拌下注入300mL沸水中，将残余淀粉糊用少量蒸馏水洗入沸水中，继续煮沸至透明，迅速冷却到20℃，在20℃用水定容至500mL。
乙酸-乙酸钠缓冲液：量取30mL冰乙酸，加水稀释并定容至1000mL，另称取34g乙酸钠，加水溶解并定容至500mL，将两溶液混匀备用。
1mol/L NaOH标准溶液：称取40gNaOH，用水溶解并定容至1000 mL。 0.1 mol/L碘溶液：称取36g KI溶于50 mL水中，在不断搅拌下加入13g I2，完全溶解后定容至1000mL，贮于棕色瓶中，密闭，避光保存。
0.5mol/ L H2SO4溶液：量取2.8mL浓H2SO4，缓慢倒入适量水中，定容至100
mL。
2mol/L HCl溶液：量取17 mL浓HCl，倒入适量水中，定容至100mL。 0.5%淀粉指示剂：称取0.5g可溶性淀粉，用少量水调匀，注入80 mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后定容至100mL（临用前现配）。
0.1mol/L Na2S2O3标准溶液的配制：称取25g Na2S2O3·5 H2O和0.1g NaCO3，溶于刚煮沸冷却后的蒸馏水中，并定容至1000 mL，贮于棕色瓶中，在暗处放置3-5天后标定。
四、实验步骤
1、Na2S2O3溶液的标定
称取于130℃干燥2h的K2Cr2O7两份，每份0.15g，分别置于2个碘量瓶中，用25 mL水溶解，加KI 2g，2 mol/L HCl溶液5mL，摇匀，于暗处反应10min，加水150mL，立即用待标定的Na2S2O3溶液滴定至浅黄色，加入3 mL 0.5%淀粉指示剂，继续滴定至溶液由蓝色变为亮绿色时（蓝色消失）为终点。
Na2S2O3标准溶液的计算：
c(Na2S2O3)=6m/MV×1000
式中：c(Na2S2O3)----标定后Na2S2O3溶液的浓度，mol/L； m---- K2Cr2O7质量，g；
V----滴定消耗的Na2S2O3溶液的体积，mL； M---- K2Cr2O7摩尔质量，g/mol。
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2、麦芽浸出液的制备
称取粉碎麦芽粉20g，置于已知质量的糖化杯（或烧杯）中，加入约20℃蒸馏水480 mL；
将烧杯置于40℃水浴锅中，搅拌，水浴1h，浸出淀粉酶。
取出烧杯，冷却至20℃，加20℃蒸馏水使其净重为520g，摇匀，用滤纸过滤，滤液供分析用。 3、糖化
取4个200 mL的容量瓶，编号，其中1、2号作样品测定用，3、4号作空白测定用，每瓶加入2%可溶性淀粉溶液100mL。
向1、2号瓶中加入乙酸-乙酸钠缓冲液10mL，摇匀，在20℃水浴中保温20min后，加入5 mL麦芽浸出液，摇匀，在20℃水浴中保温糖化30min，保温时间从加入麦芽浸出液算起。糖化结束，立即加入4 mL 1mol/L NaOH溶液，以终止酶的活动，摇匀，用水定容至200 mL。
向3、4号瓶中，加入0.65 mL 1mol/L NaOH溶液，摇匀，再各加5 mL麦芽浸出液，摇匀，用水定容至200 mL。 4、酶活力的测定
从以上4个容量瓶中分别吸取反应液50 mL，分别加入4个250 mL的碘量瓶中，再分别加入25 mL 0.1 mol/L碘液和3 mL 1mol/L NaOH溶液，摇匀，盖塞，在暗处放置15min，以氧化还原性的糖。
反应结束后向各瓶中分别加入4.5 mL 0.5mol/L H2SO4溶液，立即用Na2S2O3标准溶液滴定至蓝色刚好消失，记录滴定消耗的Na2S2O3标准溶液体积。 5、记录：
样品质量m Na2S2O3溶液浓度c Na2S2O3溶液体积V1 Na2S2O3溶液体积V2 Na2S2O3溶液体积V3 Na2S2O3溶液体积V4 6、计算
X=(V1-V2)c×342/(1-w0)
式中：X----100g无水麦芽的糖化力，WK；
V1----空白滴定消耗Na2S2O3溶液的体积（3、4号瓶的平均值），mL； V2----样品滴定消耗Na2S2O3溶液的体积（1、2号瓶的平均值），mL；
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c----Na2S2O3标准溶液的浓度，mol/L； w0----麦芽中水分的质量分数； 342----转换系数。
五、注意事项
1、100g无水麦芽的糖化力是指100g无水麦芽在20℃，pH4的条件下分解可溶性淀粉30min，产生1g麦芽糖为1个维柯（WK）糖化力单位。 2、转换系数342由以下公式计算而得：
0.171×200/50×500/5×100/m
式中：0.171----1 mmol麦芽糖的质量为0.171g； m----样品的质量，g；
当所用的麦芽样品质量为20g时，转换系数为342；
3、在淀粉糖的实际生产过程中，淀粉先经耐高温α-淀粉酶和液化喷射器共同作用完成液化，将长链淀粉随机切割成短链，再由糖化酶从短链淀粉分子非还原性末端降解α-1，4糖苷键，生成游离葡萄糖。但糖化酶活力测定时，只能用糖化酶直接从淀粉的非还原性末端分解α-1，4糖苷键，测定的酶活力可能要比实际生产中用的活力低一些。
4、结晶的Na2S2O3·5 H2O一般均含有少量杂质，同时还容易风化和潮解，需用间接法配制。Na2S2O3容易受空气中的O2、溶解在水中的CO2、微生物和光照等作用而分解。它在碱性介质中比较稳定。所以配制溶液时，为了减少溶解在水中的CO2和杀灭水中的微生物，使用新煮沸的冷蒸馏水配制溶液，并加入少量的NaCO3，其浓度约为0.02%，以维持溶液的微碱性，防止Na2S2O3分解。日光能促使Na2S2O3溶液分解，故Na2S2O3溶液贮于棕色瓶中，并放置暗处。长期保存的溶液，应每隔一段时间重新标定。如发现溶液变浑浊（有固体析出）时，就应过滤后重新标定，或重新配制。
5、标定Na2S2O3溶液，常选用强氧化剂如KIO3、KBrO3或K2Cr2O7等作基准物质，这些物质均能与KI反应析出定量的I2。
六、思考题
1、哪些因素会影响糖化酶活力的测定？ 2、麦芽浸出液加碱液的目的是什么？
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七、参考文献
1、吴国峰等．工业发酵分析．北京：化学工业出版社，2006 2、姜淑荣．发酵分析检验技术．北京：化学工业出版社，2008
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