昆虫感受气味物质的分子机制研究进展

·综述·

昆虫感受气味物质的分子机制研究进展*

王桂荣吴孔明**郭予元

(中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室，北京100094)

摘要：昆虫的嗅觉识别过程是非常复杂的，多种蛋白参与了这一过程，这些蛋白包括气味结合蛋白、气味降解酶以及气味受体等。综述了气味结合蛋白、气味降解酶、气味受体以及化学电信号的转化和传导等方面的最新研究进展。

关键词：嗅觉系统；气味结合蛋白；气味降解酶；气味受体；化学电信号传导

ResearchAdvanceonMolecularMechanismofOdorsPerceptioninInsects

WANGGui-RongWUKong-Ming**GUOYu-Yuan

(StateKeyLaboratoryofPlantDiseaseandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,

Beijing100094,China)

Theolfactorybehaviorofinsectsisverycomplicatedandinvolvesmanykindsofproteins,namely,odorant-binding

proteins,odorantdegradingenzymesandodorreceptorsetc..Somerecentadvancesonthemandchemo-electricalsignaltransductionarereviewed.

olfactorysystem;odorant-bindingprotein;odorantdegradingenzyme;odorreceptor;chemo-electricalsignal

transduction

在长期的进化过程中，昆虫嗅觉系统已经成为

一个高度专一、极其灵敏的化学监测器。昆虫通过这种复杂的嗅觉系统鉴定和识别环境中的特异性化学气味分子，并将这些化学信号转化为电信号，从而启动了昆虫的专一行为反应，如寻找食物和配偶、搜寻产卵及生殖场所、避免不利环境的伤害等[1~3]。探索昆虫对外界气味分子的识别机制，不仅有利于阐明昆虫行为反应的本质原因，而且为研究无脊椎和脊椎动物的嗅觉行为提供了理想的模型。

昆虫对外界气味分子的识别是一个非常复杂的过程，研究表明，位于昆虫触角感器中的多种蛋白参与了这一过程，这些蛋白包括可溶性气味结合蛋白[4]、气味降解酶[5,6]以及与神经膜紧密相连的气味受体等[7,8]。本文综述了气味结合蛋白、气味降解酶、气味受体以及化学电信号的转化和传导等方面的最新研究进展。

1气味结合蛋白

王桂荣:男,1972年出生,博士。E-mail:.在参与气味分子识别的蛋白或酶类中，气味结合蛋白最为丰富，它位于触角感器的淋巴液中，直接与外界环境中成千上万的气味分子接触。气味结合蛋白识别和结合外界气味分子是昆虫感受外界气味分子的第一步生化反应[9]。昆虫气味结合蛋白是一类分子量小、高度水溶性的酸性蛋白，在许多昆虫中已经鉴定存。昆虫气味结合蛋白主要分为两类：性外激素结合蛋白(PBP)和普通气味结合蛋白(GOBP)。PBP存在于专一性识别性外激素的感受器中，而GOBP存在于对普通气味分子发生反应的感受器中。在有些种类的昆虫中，已经发现了多种不同的GOBP和一种或几种PBP。序列分析表明，所有的气味结合蛋白中都具有6个保守的半胱氨酸，通过3个二硫桥相连在一起[10~12]。我们对昆虫(主要是鳞翅目)气味结合蛋白的生化特性、分子结构、分布及功能等进行过综述[13]。近几年，这方面的研究从鳞翅目和模式昆虫果蝇的研究扩展到了许多其它目的昆虫

*基金项目：国家自然科学基金重点项目(No.30330410)和国家重点基础研究发展规划(973)项目(No.G2000016208)资助。

**通讯作者。Authorforcorrespondence.E-mail:.收稿日期：2003-11-05接受日期：2004-02-22

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第6期王桂荣等:昆虫感受气味物质的分子机制研究进展

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(如双翅目、膜翅目和竹节虫目等)，从触角感器中分离得到了一些新的气味结合蛋白或类似蛋白(又称化学感应蛋白，chemoreceptionproteins)。

成虫触角中鉴定了Bohbot等[14]从

两个新的气味结合蛋白，它们的N端氨基酸序列与以前报道的蛾子的性外激素结合蛋白和普通气味结合蛋白没有同源性，但是，其中一个蛋白Mbra-AOBP2的N末端序列与在其它昆虫触角感受器中发现的一些蛋白具有很高的同源性(60%耀

与果蝇的射精管球专一性蛋白EBSP-芋同源73％)，性达80％，这两类蛋白在体外都能结合11-十八碳

膜烯酸乙酯(vaccenylacetate)。目前，已经在双翅目、

翅目、鳞翅目和竹节虫目等昆虫中找到了这类新的化学感应蛋白。这类蛋白虽然与以前报道的气味结合蛋白没有同源性，并且氨基酸序列中只有4个保守的半胱氨酸(以前报道的气味结合蛋白氨基酸序列中有6个保守的半胱氨酸)，但是这类蛋白也位于

在多昆虫感受器中，可能参与气味分子结合。目前，

种昆虫的触角感受器中发现了这类蛋白家族[15~17]。Picimbon和Leal[18]从3种蜚蠊中分离得到了多种触角专一性的蛋白，根据N端氨基酸序列的一致性，蜚蠊触角蛋白可以分为3类：(1)与果蝇触角蛋白（OS-D）氨基酸序列具有同源性；(2)与

的嗅觉蛋白具有相似性；(3)蜚蠊触角特异性

蛋白，与其它已知的蛋白都没有相似性。大部分的蛋

也有一些具有性别专一白在雌、雄蛾触角中都存在，

性，这些蛋白的确切的生理功能还有待进一步研究。

近几年对鳞翅目除了研究范围有所扩展以外，

昆虫触角气味结合蛋白的研究也更加深入。一方面是继续探索气味结合蛋白的分离纯化，研究它们的生理功能[19]，另一方面，主要加强了气味结合蛋白基因的表达研究，从中获得足够的晶体蛋白用于研究蛋白的空间构象与功能的一致性，或者是制备抗体，利用原位杂交和免疫组织定位的方法研究气味结合蛋白的分布与功能的关系[20~22]。通过简并引物PCR结合RACE技术克隆了我国主要棉花害虫———棉铃虫触角中的3类气味结合蛋白全长基因(、和)，并且在大肠杆菌中成功表达了其中两类气味结合蛋白(rPBP-Harm和rGOBP2-Harm)，通过亲和层析分离纯化获得了大量纯化的棉铃虫触角气味结合蛋白，并且免疫兔子制备了高度专一性的抗体，然后对PBP-Harm和GOBP2-Harm在棉铃虫触角感器中的分布进行了免疫定位。结果表明：PBP和GOBP2存

在于触角毛形感器或锥形感器的淋巴液和感受器着

在雄蛾触生腔中，不存在于树突或感受器表皮壁中。

角中，PBP主要存在于毛形感器中，不存在于锥形感器中；而GOBP2主要存在于锥形感器和一些中等大小的毛形感器中。然而，在雌蛾触角中，PBP存在

长于少部分的锥形感器和中等大小的毛形感器中，形毛形感器中不存在PBP；而GOBP2不但存在于

大部分的锥形感器和部分中等大小的毛形感器中，而且还存在于部分的长形毛形感器中。由此可见，棉铃虫触角中气味结合蛋白的分布与其功能是一致的

24][13,22，。Damberger等[25]在大肠杆菌中成功表达了家蚕

），并且纯化获得性外激素结合蛋白基因（

了重组的BmPBP蛋白，通过核磁共振(NMR)光谱证明了蛾性外激素结合蛋白(BmPBP)的存在形式及构象与pH值有关，当pH值大于6.0时，Bm-PBP以碱性形式存在(BmPBPB)，而当pH值小于4.9时，以酸性形式存在(BmPBPA)，pH值在4.9与6.0之间时，以A和B两种混合形式存在，这两

在其它的OBP中也观察到了种形式可以相互转换。

气味结合蛋白具有多种构象，表明依赖于pH值的构象多态性可能是这类蛋白的共同特征。在pH值低于5.0时，OBPs不与配体发生结合，表明pH的改变影响折叠构象，这种影响在嗅觉过程中可能起着重要的生理作用[26~28]。将PBP同细胞膜混合，在UV附近的圆二色性()测定表明BmPBP的构象发生改变，因此，当BmPBP接近树突膜，其构象转变为BmPBPA形式，使配体释放出来刺激受体分子[25,29]

。用X-光线晶体衍射法研究了BmPBP与

在pH8.2时，bombykol复合物的结构，BmPBP-bo-mbykol复合物形成6个琢-螺旋，这6个琢-螺旋通

过3个二硫桥连接在一起，将配体完全包裹起来，bombykol结合在BmPBP的亲脂性口袋中，在溶液中得到了保护[30]。在BmPBP-bombykol复合物结构中，没有观察到配体进入亲脂性口袋的入口和出口，Sander等[30]认为可能是覆盖性外激素结合口袋的一个环移到一边或者这个蛋白有部分不折叠，配体可以通过这部分与口袋进行结合或释放出来。为了阐明配体与气味结合蛋白结合和释放的过程，明确pH的改变对气味结合蛋白构象的影响，Horst等[21]利用NMR研究了BmPBP的所有构象及其生理功能，结果表明BmPBPA与BmPBP-bombykol复合体晶体结构在构象上明显不同。C-末端131耀141位氨基酸

在复合体残基位于BmPBP-bombykol复合体表面，

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农业生物技术学报2004年

而在BmPBPA中形成一个中形成一个伸展的构象，

并且位于BmPBPA蛋白核心位置。这是分琢-螺旋，

子内的一种新的机制，通过蛋白构象的改变，使

参与构象BmPBP能够结合和释放外界的气味分子，

改变的氨基酸彼此不相邻。这些研究很好地解释了为什么气味结合蛋白能够选择性地结合气味分子，又能在合适的条件下释放出气味分子。

其触角专一性的mRNA片段，

中一个克隆与昆虫谷光甘肽-S-转移酶基因家族具有很高的同源性，结合RACE技术克隆了该基因。Northern杂交表明，它在棉铃虫触角中专一性表达，并且在雄蛾触角中的表达量明显比雌虫中高，这与棉铃虫性外激素结合蛋白基因的表达相似。根据该基因在昆虫触角中的表达情况以及已经报道的谷光甘肽-S-转移酶在昆虫中所起的作用，推测该基因与性外激素的分解有关，同时可能参与触角中毒性分子的分解[33]。对于性外激素如何与受体相互作用以及性外激素失活过程的分子机制的研究目前正在

根据对的研究，Kaissling[34]对进行中。

此提出了一个新的模型，该模型认为，性外激素与还原性的性外激素结合蛋白相结合并穿过水溶性的淋巴液到达神经膜受体，该复合物与受体结合后，性外激素结合蛋白由还原型变为氧化型，从而使结合到性外激素结合蛋白上的性外激素的刺激失活。随着多种参与气味识别的蛋白的基因逐渐被克隆出来，利用定向突变研究复合物的形成与刺激失活，进一步验证以上模型的正确性成为可能。

除了在鳞翅目昆虫中发现了气味降解酶外，Wojtasek和Leal[29]报道从几种甲虫触角中提取的蛋白可以降解其自身的性外激素，性外激素的失活可能是通过内酯环的解开而达到。扁绿丽金龟

的酯酶对R-japonilure和S-ja-ponilure表现出不同的亲和力，对前者的亲和力较大。这可能与该虫以R-japonilure作为性外激素有关。对分异发丽金龟的性外激素的解离产物表明，只有触角提取物能解离性外激素，并且性外激素降解酶需要尼克酰胺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）和尼克酰胺嘌呤二核苷酸（NADH）存在时才有活性。

2气味降解酶

当气味分子刺激感受器神经膜受体后，一定存在某种机制降解剩余的气味分子，否则昆虫会因为连续刺激而死亡。1981年，Vogt和Riddiford[4]首先报道在多声大蚕蛾触角中存在一种酯酶，这种酯酶

并能够降解多声大蚕蛾性外激素中的乙酸酯组分，

且在雄蛾触角中特异性表达。随后，Rybczynski等[31]

多声天和Preswich等[5]分别在烟草天蛾、烟蚜夜蛾、

蚕蛾和家蚕触角中发现了一类能够分解醛类化合物的醛氧化酶，这类醛氧化酶在雌雄蛾触角中均存在，但在雄蛾触角中含量更丰富。因此这种酶可能起着双重的作用，一方面主要分解性外激素中的醛类物质，另一方面还可能参与普通气味的分解作用，因为醛类化合物普遍存在于植物挥发物中。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳研究表明，烟草天蛾醛氧化酶分子量在145~150kD，家蚕醛氧化酶分子量为130kD，它们在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中均出现2条带，表明它们以二聚体形式存在。而多声大蚕蛾醛氧化酶分子量为175kD，在变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上都只有1条带，因此，它可能以单体的形式存在。

到目前为止，已经发现了几类在昆虫触角中高水平表达的酶类，即酯酶、氧化酶类和谷胱甘肽-S-转移酶，这些酶都可能参与气味分子及有毒物质的降解。随着分子生物学的发展，这方面的研究已经开始深入到分子水平。从果蝇触角中克隆了一个编码NADPH(尼克酰胺嘌呤二核苷酸磷酸)细胞色素P450氧化还原酶基因，该基因在果蝇触角中专一性高水平表达，暗示它可能与触角中剩余气味分子的清除有关[32]。从烟草天蛾触角中克隆了一个谷胱甘肽-S-转移酶的cDNA序列，它在昆虫触角中专一性表达，并且在雄蛾触角中的表达量明显高于雌虫。这种酶在昆虫触角中可能起着双重的作用，一方面保护昆虫嗅觉系统免受有毒物质的伤害，另一方面能够使醛类物质特别是性外激素复合物失活[6]。最近，我们利用差异显示PCR分离得到了3条棉铃虫

3气味受体

除了气味结合蛋白的初步过滤和识别外，动物

对成千上万种结构各异的气味分子的识别主要依赖于气味受体介导的气味分子与嗅觉神经的专一性结

变异及专一性对于合。因此，研究气味受体的特性、

阐明嗅觉识别的分子机理也是非常重要的。经过长期的研究，首先在老鼠嗅觉上皮细胞中发现了一类G-蛋白偶联的受体家族，它们参与气味信号的识别。随后在小鼠、鱼、青蛙和人体内也发现了这类受体家族的基因[35~38]。这些推断的气味受体具有G-蛋

如有7个亲脂性跨膜区、一个糖白偶联受体的特征，

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基化位点和一个磷酸化位点。根据推测在哺乳动物中有1000多种这样的气味受体参与气味的识别。无脊椎动物中相应的化学受体最近才在线虫和果蝇

已鉴定中发现[8,39,40]。分析线虫基因组的测序结果，

了500多个编码G蛋白偶联的化学受体基因，目前研究过的这类受体基因主要在化学感觉神经中表达。并且多种化学受体基因在同一个神经中表达，由此推测，在线虫中单个神经细胞能够识别多种气味[50]

。因此，尽管线虫化学感觉神经数量有限，但是它能够对大量的化学刺激作出反应。在已经发现的线虫气味受体基因中，仅ODR-10受体的嗅觉功能得到了实验的证实。ODR-10受体基因在AWA感觉神经（这类感觉神经是识别挥发性复合物的三类细胞之一）中高水平表达[41]。用激光杀死AWA神经细胞，线虫识别双乙酰和吡嗪的能力减弱。如果线虫突

基因或缺失控制在变体中缺失

AWA神经中表达的编码转录因子ODR-7，则这种突变体识别双乙酰和吡嗪的能力完全丧失。但是在另一转录因子控制下，突变体中基因表达得到恢复。基因的存在是线虫嗅觉行为反应的充分必要条件。然而，对气味行为反应的本质并非由受体本身决定，因为基因在AWA感觉神经中表现为对双乙酰具有引诱作用，而在AWB感觉神经中表现为对双乙酰具有趋避作用。这充分证明了线虫对气味刺激的行为反应是感觉神经受体和周围神经组织相互作用的结果。

线虫和各种哺乳动物嗅觉受体基因的发现刺激人们利用同源搜索的方法开始寻找类似的基因。在过去的10多年中，很多实验室尝试了多种搜索同源基因的方法，如比较已经发现的受体基因同源性设计简并引物进行RT-PCR扩增，或利用哺乳动物的嗅觉受体基因筛选昆虫cDNA文库，但是均以失败告终。近年来，通过搜索果蝇基因数据库中编码与已知嗅觉受体有关的结构基因，两个研究组地报道了可能编码果蝇气味受体蛋白的基因。Clyne等[38]利用一种多变量计算程序首先发现了2个编码有7个跨膜区域的受体基因，它们在化学感觉细胞的一个亚族中特异性表达。与此同时，Vosshall等[8]利用差显克隆策略在果蝇也发现了可能的气味受体基因，它们仅在果蝇嗅觉器官特别是触角下颚须中表达。在果蝇基因组数据库中进行同源搜寻，总共找到了17个相关的序列。有趣的是这些受体蛋白基因形成了一个高度变异的家族，即所发现的各种气味受体基因之间同源性很低，而且与线虫和脊椎动物或

其它的G-蛋白偶联受体家族根本没有同源性。这就说明了为什么早期应用同源搜寻的方法在昆虫中寻找与脊椎动物受体基因相似的基因没有取得成

线虫和果蝇的功。现在，还不清楚为什么脊椎动物、

嗅觉受体同源性如此之低。

原位杂交已经研究证实果蝇嗅觉受体基因家族的成员在触角嗅觉神经和下额须的化学受体细胞中高效表达，不同的嗅觉受体在某些确定的细胞亚群中表达，并且在个体间某一确定的受体的空间表达方式非常相似。没有观察到单一神经中有几种受体基因共同表达的现象[8]。综合考虑感觉神经的总的数量、基因组中受体基因的数量及表达确定的受体的细胞数量，可以推测每个感觉神经仅仅有几类受

目前的资料仍不足体（甚至只有一类受体）。然而，

以确定每个细胞中表达的受体的数量，因此这方面仍需进一步研究，确定果蝇中受体基因的表达是与脊椎动物相似或是与线虫相似。在脊椎动物中一个

而感觉细胞仅仅有一种或几种气味受体进行表达，

在线虫中一个化学感觉细胞中有多个受体基因进行表达。

单个神经细胞中受体基因表达数量的控制机制及基因组中特定受体基因的激活过程知之甚少。而这一过程恰恰是嗅觉神经细胞识别专一性气味的基础，因为每个感觉细胞中气味受体不同表达方式决定了它对气味刺激的不同行为反应能力[40]。在果蝇中发现POU区域转录因子Acj6控制触角细胞对化学气味的感受能力。对果蝇突变体的研究揭示了一类嗅觉受体基因的正确表达受基因的控制，并且一类嗅觉神经对气味的专一性至少部分由这类气味受体基因转录因子控制。

如前所述，已经对多种昆虫OBP的分子结构及生理功能进行了深入的研究，在果蝇中已经发现了几种OBP，现在又发现了多种气味受体基因，并且OBP与嗅觉受体的表达在空间上重叠。OBP的主要功能是选择性地结合和运输气味分子穿过水溶性的淋巴液到达并且刺激神经膜上的气味受体，今后有必要对这两类蛋白的相互作用进行研究，这有助于理解外周受体和嗅觉神经受体在气味识别中所起的作用。

4化学电信号传导

当外界气味分子与感觉神经膜上的气味受体结合并刺激感觉神经元时，感化性神经元将化学刺激

电信号以动的性质、强度及持续时间转变为电信号，

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农业生物技术学报2004年

作电位的形式沿轴突传播到达更高一级的感觉中心，并在这里对各种电信号进行整合，发放神经冲动，使动物产生特异的生理和行为反应。利用生物化学、电生理和分子遗传学对分类地位各异的不同动物进行研究结果表明，化学信号的传导过程在不同动物间是基本相同的，类似的分子参与了这一传导

具体来说，气味分子与感觉神经表面的嗅过程[43～45]。

觉受体相互作用启动了细胞内与G蛋白偶联的级

联反应。活化的G蛋白依次激活第二信使级联反应中的关键性酶。被激活的腺苷酸环化酶催化ATP环化形成cAMP，同时，被激活的磷酸酯酶C裂解细胞膜上的磷脂酰肌醇，释放出肌醇三磷酸和二酰甘油。细胞内介质浓度的迅速升高激活了质膜上的离子通

对脊椎动物化学电信道，从而产生了一个受体电位。

号传导过程中细胞内的级联反应研究得较为清楚，cAMP途径和IP3级联反应是两种替代途径。

在无脊椎动物嗅觉信号的传导过程中也存在与脊椎动物相似的第二信使途径。特别是对对虾的嗅觉神经的化学感受信号的传导途径进行了详细的研

短暂地刺激导致嗅觉究。在对虾中，气味分子迅速、

受体细胞外围树突中cAMP和IP3的形成，cAMP

而途径导致钾通道的活化和细胞电位的超极化，

IP3途径开放了阳离子通道并由此导致嗅觉神经电位的去极化[56,57]。环核苷酸和IP3门控的离子通道能够在同一细胞中发生，由此推测嗅觉细胞不仅能对化学信号进行传导而且能够对其进行加工。外界气味分子通常是由多种化合物组成的复合物，它们刺激单个嗅觉神经产生不同的反应，因此对虾中受体的分布与线虫相似，单个嗅觉神经细胞中可能不止一种气味受体[44,46,47]。

在昆虫中信号传导的机制仍不清楚，但是可以肯定，也存在cAMP和IP3两种信号传导途径。首先，以果蝇（PLC）基因突变体进行实验表明，果蝇对气味的反应需要存在完整的基因，即需要PLC的参与，受到性外激素刺激的果蝇体内IP3含

发量增加，表明果蝇体内存在IP3传导途径。其次，

现环核苷酸敏感通道在果蝇触角中的表达是果蝇识别气味所必须的。因此，在果蝇识别外界气味的过程中也存在两种信号传导途径[48,49]。

最近，在线的无脊椎动物的嗅觉机理具有借鉴作用。

特虫和果蝇中揭示了介导电化学传导过程的分子，

别是在果蝇中发现了气味受体，因此，可以使用模式昆虫对嗅觉识别过程进行研究(图1)。这也带动了对作物害虫和人体传病昆虫的嗅觉识别机制的研究。对相关受体以及信号传导因子的深入理解，有利于我们寻找新的化合物，用于干扰昆虫嗅觉识别，最终可以不使用神经毒剂，达到控制害虫的目的。因此，

图1.昆虫嗅觉感受器及其对气味物质识别的生化和分子机

制图解（来自于Vogt[50]）

Fig.1.Schematicofolfactorysensillumandageneralized

biochemicalpathwayofodorreception[50]A.嗅觉感受器模式图。有2～3个神经细胞(neuron)，周围有3个支持细胞(supportcell)。B.亲脂性气味分子经感受器表皮细胞壁(cuticle)上的孔洞进入亲水性的感受器淋巴液(hemolymph)。亲脂性的OBP结合和运输气味分子到达位于神经膜上的受体蛋白，感受器支持细胞中淋巴腔(lumen)中的ODEs（途径I）降解这些气味分子，有降解毒性分子(

)的酶，如GST（途径IIa），这些酶也可以分解

（途径IIb）多余的气味分子，OBPs和Ors之间以及它们与SNMP之

33]间的相互作用仍不清楚[6，。

A.Anolfactorysensillumincludes2~3neuronssurroundedby3supportcells;

B.

Hydrophobicodormoleculesentertheaqueoussensillum

lumenviaporespenetratingthecuticularhairwall.HydrophilicOBPsareproposedtobindandtransportodorstoreceptorproteinslocatedintheneuronalmembranes.ODEs(pathwayI)inthesensellumlumenareproposedtodegradetheseodormolecules.Cytoplasmofsupportcellscontainxenobioticinactivatingenzymes,transferase(pathwayIIa)

suchasglutathione-S-

5展望

昆虫的嗅觉系统的构造、生理功能以及参与化

学识别的分子等，与脊椎动物有很多相似之处，因此研究昆虫的嗅觉识别机理，对研究脊椎动物和其它

whichmayalsoservetoinactivateodor

molecules(pathwayIIb).InteractionsbetweenOBPsandOrsandthe

33]

functionofSNMPareunclear[6，.

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对于昆虫嗅觉识别机制的研究不仅可以揭示生物体识别环境中气味分子的基本原理，而且还具有重要的生态和经济意义。

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农业生物技术学报2004年

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inducedby

pheromone-bindingproteinfrom274:30950~30956

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silkworm

moth:

Structure

of

theChem

A

pheromone-binding-protein–bombykolcomplex.Biol,2000,7:143~15131RybczynskiR,themoth32HovemannBT,

ReaganJ,

LernerMR.

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