第３１卷第１期 海 洋 学 报 Ｖｏ１．３１．Ｎｏ．１ ２００９年１月 ＡＣＴＡ ＯＣＥＡＮｏＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ Ｊａｎｕａｒｙ ２００９ 宽壳全 海笋受精和早期胚胎发育过程的细胞学观察 董迎辉 ，柴雪良 ，陆荣茂 ，林志华 ，肖国强 ，张炯明。 （１．浙江万里学院生物与海洋学院，浙江宁波３１５１００；２．浙江省海洋水产养殖研究所，浙江温州３２５００５） 摘要：用普通光镜和石蜡切片技术，系统观察了宽壳全海笋卵子在受精和早期胚胎发育过程中的外 形和核相变化。结果发现，宽壳全海笋成熟未受精卵呈梨形或卵圆形，核相处于第一次成熟前 期，有明显的生发泡和核仁；精子为鞭毛型，全长（４４．０４２±１．１６６）／．ｔｍ，头部呈椭圆形，前端的顶体 略呈钝锥状；在水温２４℃条件下，精、卵混合后，精子迅速附着于卵子表面，启动卵子发育；受精后 ６～９ ｍｉｎ，生发泡逐渐萎缩、破裂，随后精子进入卵内并轻微膨胀；受精后２Ｏ，３Ｏ ｍｉｎ，受精卵先后 排出第一、第二极体，完成第一次和第二次成熟；成熟结束后，精、卵核体积迅速膨胀，核膜 重新出现，形成弥散状的雌、雄原核，雄原核形成略早于雌原核；受精后４０ ｍｉｎ左右，雌、雄原核在 卵子以原核联合的方式结合，随后联合核的染色体共同排列在纺锤体的赤道板上，形成第一次 有丝的中期相；随着有丝的进行，染色体被纺锤丝拉向两极，结果在受精后约５０ ｒａｉｎ 形成２个大小不等的卵裂球，第一次卵裂结束；第二次卵裂过程与第一次卵裂基本相同，只是卵裂 方向与第一次卵裂基本垂直，在受精后６５～７０ ｍｉｎ，第二次卵裂完成，形成１大３小４个卵裂球。 另外，实验中发现了少量的多精入卵和多极分离现象。 关键词：宽壳全海笋；受精；早期胚胎发育；细胞学观察 中图分类号：Ｓ９１ ７ 文献标识码：Ａ 文章编号：０２５３—４１９３（２００９）０１－０１２５—０７ １ 引言 究①，累计培育出壳长１ Ｉｎｍ以上的稚贝７ ０００余万 颗，并对其染色体核型ｌ２ 和稚贝呼吸代谢及对若于 宽壳全海笋Ｂａｒｎｅａ ｄｉｌａｔａｔａ（Ｓｏｕｌｅｙｅｔ）隶属于 环境因子的适应性ｌ＿３ 等进行了研究。 瓣鳃纲（Ｌａｍｅｌｌｉｂｒａｎｃｈｉａ）、异齿亚纲（Ｈｅｔｅｒｏｄｏｎ— 开展贝类受精生物学研究，不仅能深入了解其 ｔａ）、海螂目（Ｍｙｏｉｄａ）、海笋科（Ｐｈｏｌａｄｉｄａｅ）、全海笋 受精机理和遗传机制，还有利于解决人工育苗和新 属（Ｂａｒｎｅａ），分布于菲律宾、日本和我国沿海，多在 品种培育实践中遇到的许多实际问题。石蜡切片技 河口附近的软泥底质中潜居生活ｃＩｊ。由于宽壳全海 术是受精细胞学的重要研究手段之一，具有技术成 笋个体大、水管肌发达、肉味鲜美、营养价值高，且生 熟、组织结构保存完好、观察方便等优点，已被用于 长速度快、养殖周期短、经济效益显著，养殖开发前 椭圆背角无齿蚌Ａｎｏｄｏｎｔａ ｗｏｏｄｉａｎａ ｅｌｌｉｐｔｉｃａ［ 、 景广阔。目前，有关宽壳全海笋的基础研究和生产 皱纹盘鲍Ｈａｌｉｏｔｉｓ ｄｉｓｃｕｓ ｈａｎｎａｉ［５］、栉孔扇贝 实践的报道均很少。本研究组自２００３年以来对宽 Ｃｈｌａｍｙｓ ｆａｒｒｅｒｉ［ 、文蛤Ｍｅｒｅｔｒｉｘ ｍｅｒｅｔｒｉｘ［ 等贝 壳全海笋的繁殖特性和人工繁育技术进行了研 类受精过程的研究。本实验采用普通光镜和石蜡切 收稿日期：２００８ ０３～１８；修订日期：２００８ １２－ｌ ５． 基金项目：国家科技基础条件平台建设项目（２００５ＤＫＡ３０４７０—０１５）；浙江省科技厅重点科研项目（２００４Ｃ２２０２１）；温州市科技局项目 （￥２ｏｏ３Ａ００２）。 作者简介：董迎辉（１９８０～），男，河南洛阳人，助理研究员，从事海洋贝类遗传和发育生物学研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｄｏｎｇｙｉｎｇｈｕｉｌ１８＠１２６．ｃｏｒｎ ＊通讯作者：ｃｃｘｙ［＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ ①柴雪良，方军，张炯明，等．宽壳全海笋人工繁育技术研究．水产学报，待发表 126海洋学报31卷片技术对宽壳全海笋受精和早期胚胎发育的细胞学过程进行了系统观察对于丰富海产双壳贝类受精，的直径和品用B，30个精子的长度。石蜡切片样品的采集方法同前ou。将各期胚胎样，生物学理论和开展宽壳全海笋人工育苗乃至细胞工程育种均具有重要价值。in氏液固定，70％酒精置换、4℃保存、。切片前将样品用梯度酒精脱水埋金华益迪YD，二甲苯透明石蜡包，22．材料与方法11508A型切片机连续切片切片，，厚度约复次5“m。苏木精伊红染色中性树胶封片观察并拍照。材料在显微镜的油镜下(，×1000)实验重宽壳全海笋亲贝采自温州洞头海区滩涂壳长5～3。7cm，外观无破损或伤病，。亲贝经过。10d左右的强化促熟即可作繁殖之用验于2()07受精和早期培育实染色。33．结果1年5月中旬在浙江省海洋水产养殖研究，。宽壳全海笋精子和卵子的形态结构所清江基地进行所取样品带回实验室分析宽壳全海笋精子为典型的鞭毛型全长(44，．042±用苏木精和伊红染料均为AMRESC()公司产品2．1．166)肛m，由头部中段和尾部、3．部分组成“m，。精子2方法取性腺饱满的宽壳全海笋亲贝10头部为椭圆形长度为(1，．943±O173)，前端的枚阴干，2～顶体略呈钝锥状；中段较短由单层的线粒体围绕而3h进行催产然后单个放人盛有过滤海水的烧杯，。成长为(O，．628±O056)．扯m，；尾部为细丝状鞭毛．，中采集精卵24205m选择镜检质量好的精。、卵在水温，，在近头端较粗向远端渐细长(42，900±1．187)肚m。C条件下进行人工受精和孵化m从受精开始90m(图12)。in内每隔一3，min取样一次，20～in。每隔样品见1宽壳全海笋刚产出的卵子形状不规则多数呈，in．取样m次每次取卵量不少于。1。004粒梨形或卵圆形生发泡明显生发泡内颜色较浅可，，，～用01ol／dm，PBS(pH47．4)。配制的％多聚甲醛2个核仁(图一11)。从石蜡切片结果来看未，溶液固定保存于℃，冰箱中普通光镜观察的样，受精卵核相处于第次成熟前期卵质内含量，，品直接滴于载玻片上加盖玻片制成水装片在可见丰富的的卵黄颗粒被染成鲜红色巨大的生发泡内分布着着色很浅的染色质细丝(图21)光下观察拍照并用、，DT20¨。O软件测量30个卵子。图11．．宽壳全海笋受精及早期胚胎发育过程的光镜观察；3．生发泡阶段的未受精卵；2精子．精子附卵；4生发泡破裂．；5．第一极体排出；6第二极体排出；7．．2细胞期．84细胞期(Gv：生发泡；Nu：核仁；H头部：；MP：中段；T：尾部；sP：精子；PBl：第一极体；PB2：第二极体)1期董迎辉等：宽壳全海笋受精和早期胚胎发育过程的细胞学观察127图21．宽壳全海笋受精和早期胚胎发育过程的石蜡切片观察精子附卵；；生发泡阶段的未受精卵；11．；2．3～5．生发泡萎缩．；6，7．生发泡破裂；8第．．一次成熟中期～；9，10．第一次成；熟后期18～第二次成熟中期；21．12一，13第二次成熟后期；14雌雄原核的形成；15、17；．雌雄原核靠近、．20～．雌雄原核的染色体联合、第次卵裂中期；；22～24．．第一次卵裂后期；35．；25，26．2．细胞期：27第二次卵裂中：：期；2831．第二次卵裂后期染色体；sD：；32．4细胞期l：33．多精人卵PB2；：；34多精核原核化；FP多极分离(GV生发泡；NU核仁；sNPN：精核；CHS：纺锤体；PB第一极体第二极体SD：N：雌性原核；M雄性原核；CHT：染色质；CF：卵裂沟P；多极纺锤体)１２８ ３．２精子入卵和生发泡破裂 精、卵混合后，精子借助尾巴的摆动迅速附着于 卵子表面，附着部位随机（图１－３）。受精后３ ｍｉｎ， 精子逐渐插入卵膜，开始启动卵子发育（图２ ２）。 从受精后６ ｒａｉｎ开始，生发泡开始逐渐缩小，形状变 得不甚规则，在核仁附近的染色体首先螺旋变粗（图 ２—３，４）。随着生发泡的进一步萎缩，核膜边缘越来 越模糊，而染色体的螺旋化程度也继续加剧 （图２－５～６）。受精后９ ｍｉｎ左右，核膜消失，生发泡 完全破裂，核液与胞质相互混杂，染色体因高度浓缩 而变得显而易见，精子进入卵内，发生第一次膨胀， 形成圆球形的精核，直径约４．０～５．０ ｐ＿ｍ（图２ ７）。 此时，卵子外形已变圆，卵径为（４８．３７４± ３．６４１）“ｍ（图１—４）。 ３．３两次成熟 受精后１５ ｍｉｎ，受精卵内形成了长约１ ５～ １８“ｍ的纺锤体结构，纺锤体的一端垂直靠近卵膜， 卵子染色体则在纺锤丝的牵引下整齐地排列于纺锤 体赤道板，核相进入第一次成熟中期（图 ２—８）。受精后１８～２０ ｍｉｎ，卵子染色体在纺锤丝的 牵拉下分为两组，分别向着纺锤体长轴的两极移动， 同源染色体分开（图２－９，１０），近卵膜端的一组染色 体慢慢向卵膜外拱，最终排出卵膜之外，形成第一极 体，完成第一次成熟（图１ ５）。保留于卵内的 染色体组则重新排列于赤道板上，形成第二次成熟 的中期相（图２ １１），接着以同样的方 式在第一极体下方发生第二次成熟，姐妹染色 单体分离，其中一组染色体在受精后约３０ ｒａｉｎ被排 出卵外，形成第二极体（图ｌ一６，图２ ｌ２，ｌ３）。在整 个成熟过程中，精核一直位于卵子皮质区一侧， 未发生显著变化。 ３．４雌、雄原核的形成、靠近和联合 受精后３５ ｒａｉｎ左右，精核发生第二次膨胀，形 成一团由核膜包围的、松散的核物质，即为雄原核； 卵子的染色体也膨大扩散，形成形状和结构相似的 雌原核，雌原核的位置靠近极体（图２ １４），此时观 察到的雄原核总稍大于雌原核。雌、雄原核体积膨 胀到最大以后，逐渐向卵子迁移（图２—１５，１６）。 受精后约４０ ｍｉｎ，雌、雄原核在卵子互相靠拢， 但二者之间的核膜依然清晰可见（图２—１７），随后两 原核的核膜破裂，染色质凝缩成的两组染色体发生 联合（图版２—１８～２０）。 海洋学报３１卷 ３．５ 早期卵裂 染色体完成联合之后，卵内重新出现纺锤体，纺 锤体的位置偏向卵子一侧，联合核的染色体整齐地 排列在纺锤体的赤道板上，形成第一次有丝的 中期相，核行将开始（图２—２１）。受精后 ４５～５０ ｍｉｎ，纺锤丝将染色体拉向两极（图２—２２～ ２４），卵细胞的外形自极体处发生纵向内缢，结果形 成２个大小不等的卵裂球，二者之间具有明显的卵 裂沟（图１—７，图２ ２５）。 第一次卵裂结束后，２个卵裂球中的染色体又 变为染色质，核膜重建，进入有丝间期 （图２—２６）。受精后６０ ｍｉｎ，两个卵裂球中的染色质 细丝逐渐螺旋变粗，形成清晰可见的染色体，排列于 纺锤体的赤道板上，其中大卵裂球的发育速度稍快 （图２ ２７，２８）。第二次卵裂与第一次卵裂过程基本 相同，在与第一次卵裂垂直的方向发生纵裂（图２— ２９～３１），到受精后６５～７０ ｍｉｎ，形成１大３小４个 卵裂球（图１－８，图２－３２）。 ３．６多精入卵和多极分离 石蜡切片结果显示，宽壳全海笋的受精卵中存 在少量的多精入卵现象，入卵的精核多能发生膨胀 解凝，有些卵子还能像正常受精卵一样排出极体（图 ２－３３）。在原核形成期，发现极个别卵内有两个以上 原核的情况，显然是多个精核发生原核化的结果，而 且各精核的原核化程度不同（图２—３４）。在受精卵 的早期卵裂过程中，观察到了多极分离的核相（图 ２—３５）。 ４讨论 ４．１ 应用石蜡切片技术进行贝类受精细胞学研究 的优缺点 石蜡切片技术曾被用于多种鱼类受精细胞学 研究中 ，但有关贝类受精过程的报道却很少。 由于多数贝类的卵子个体微小，尤其是双壳贝类， 卵径一般仅几十微米。理论上讲，石蜡切片的厚 度可达５～８ ｆｆｍ，而一个几十微米的卵子也能被切 成数片，只要有方向合适的卵子就能观察到有染 色体和纺锤体分布的切面，从而系统研究不同发 育时期的核相变化情况。在国内，已有一些学者 将石蜡切片技术应用于贝类受精细胞学研究中， 如陈竞春等 对椭圆背角无齿蚌受精细胞学过程 进行了详细观察；周丽青等 纠对杂交扇贝受精卵 的核相变化进行了系统研究；董迎辉等＿＿６］对比了 １期董迎辉等：宽壳全海笋受精和早期胚胎发育过程的细胞学观察 栉孔扇贝正常发育和人工雌核发育二倍体早期胚 胎核行为的细胞学变化。从研究方法来看，石蜡 一步研究。不同种贝类雌、雄原核的结合方式也不尽 相同，一般有原核联合和原核融合两种。原核联合是 指两性原核相互靠拢时核膜相嵌但不融合，随后两原 切片苏木精一伊红染色法可在光镜下清晰地看到 受精卵外部形态和内部结构的变化，尤其是纺锤 体的消长和两性原核结合时的核膜变化，具有不 同于压片和荧光显微术的独特优势，再加上其方 法稳定、切片结果保存期长、无需昂贵的观察仪器 等优点，不失为贝类受精细胞学研究的一种有效 方法。但是，石蜡切片法也有其明显的缺点，比如 所需样品量大，技术流程相对繁琐，找到同时切过 极体、精核、雌核或纺锤体的核相困难，不能立体 多方位观察等。因此，要对某种贝类的受精过程 进行全面深入的了解，应该采用多种研究方法。 ４．２ 宽壳全海笋和其它双壳贝类受精过程的异同 核都形成各自的染色体组，待原核核膜消失后，两组 染色体联合起来形成合子染色体组，已知近江牡 蛎＿１ 、太平洋牡蛎ｕ引、泥蚶Ｔｅｇｉｌｌａｒｃａ ｇｒａｎｏｓａ［１９Ｊ、菲 律宾蛤仔Ｒｕｄｉｔａｐｅｓ ｐｈｉｌｉｐｐｉｎａｒｕｍｌ＿２ 、文蛤 等多种 贝类属此类型。原核融合是指雌、雄原核在结合时核 膜相互融合，其内的染色质融为一体后才形成合子染 色体组，如栉孔扇贝＿】 。宽壳全海笋雌、雄原核靠 近、结合时核膜一直存在，直到两原核都形成各自的 染色体组，证明其结合方式为原核联合。 多精入卵现象普遍存在于双壳贝类 中＿６ 。 删，被认为是缺乏或者具有不完善的阻 滞多精人卵的机制。本研究发现，宽壳全海笋也具有 宽壳全海笋的成熟卵子个体较小，多呈梨形或 卵圆形，核相处于第一次成熟前期，生发泡尚 存，内有明显的核仁，这与太平洋牡蛎Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓｌ１ 、多精入卵及多极纺锤体等异常现象。有关贝类多精 入卵的形成原因，可能十分复杂，不仅与物种、卵子本 近江牡蛎Ｏｓｔｒｅａ ｒｉｖｕｌａｒｉｓ［１ 较为相似，而 身的成熟度和完整性、精卵比例等息息相关，而且与 外界的受精条件如水温、ｐＨ值等关系密切，如沈亦平 等ｌ１ ４＿对比了近江牡蛎在２５和２８．８℃水温条件下的 受精情况，结果发现２５。Ｃ组中出现了较多的多精人 卵，而２８．８℃组胚胎发育正常，出现多精人卵的胚胎 极少。至于贝类多精入卵胚胎的进一步发育和结局 与皱纹盘鲍、栉孔扇贝、文蛤等其它多数双壳贝类不 同。宽壳全海笋的卵子必须经过精子附卵的刺激， 才能启动进一步发育，生发泡逐渐萎缩、破裂，染色 体排列在纺锤体赤道板上，进入第一次成熟中 期。而太平洋牡蛎刚产 的卵子，处于第一次成熟 前期，生发泡尚未破裂，用海水浸泡一段时间， 如何，目前尚无定论，多数学者认为多精入卵会因受 精卵染色体分离紊乱而导致胚胎最终死亡。然而，在 贝类中不仅三倍体、四倍体等多倍体能够存活，而且 与整倍体染色体数接近的非整倍体也能正常生 长＿２ 船］，这就意味着贝类多精入卵胚胎的发育可能 会出现多个结果。作者根据近年来对栉孔扇贝ｌ６］、文 蛤 ］、青蛤（￣ｃｌｉｎａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ①、宽壳全海笋等贝类多精 生发泡就会自然破裂，卵子发育到第一次成熟 中期，这时受精会提高受精率和同步性ｌ】 。 雌、雄原核形成的同步性和结合方式，是贝类受 精生物学研究的热点问题。关于双壳贝类雌、雄原 核形成的同步性，如栉孔扇贝ｌ１ 、合浦珠母贝 Ｐｉｎｃｔａｄａ ｍａｒｔｅｎｓｉｉｌ１ 等多数贝类表现为不同步， 雄原核稍早于雌原核，而且形成于第二次成熟 完成以后；近江牡蛎在第二次成熟中期就有部 分精子解凝缩而膨胀为雄原核，即雄原核的形成远 早于雌原核；太平洋牡蛎的卵子在第二次成熟 人卵现象的研究，将其结局大致归纳为以下几种情 况：（１）入卵精子数太多（多于４个），抑制了卵子成熟 进程，导致受精卵发育中止于第一次或第二次成 熟期；（２）２～４个精子入卵，成熟可以进行， 排出一个或两个极体，形成的雌、雄原核发生联合，卵 以后，雌、雄原核几乎同时形成。宽壳全海笋的石蜡 切片观察发现，在第二次成熟以后雌、雄原核才 逐渐形成，此时看到的雄原核总比雌原核体积大，推 测宽壳全海笋雄原核的形成略早于雌原核。已有研 裂时染色体平均分配到两个子细胞中，形成可存活的 天然多倍体如三倍体、四倍体；（３）２～４个精子人卵， 联合核的染色体分离异常，出现多极分离现象，导致 究表明，雄原核的形成是卵内物质对精核调节作用 的结果，这种调节作用与精核核蛋白关系密切ｌ１ ， 非整倍体的产生，除了极少数与整倍体染色体数接近 的能幸存下来外，绝大多数非整倍体胚胎发育畸形而 死亡于担轮幼虫早期。 至于在各种贝类中的调节机制有何不同，还有待进 ①董迎辉，林志华，柴雪良，等．青蛤受精和胚胎发育早期核行为的细胞学变化．已投稿 １３Ｏ 海洋学报３１卷 Ｉ＝ｆ 口 口口口 Ｉ二Ｊ Ｉ＝Ｊ口口 钉幻 力 明 参考文献： 张玺，齐钟彦，李洁民．中国的海笋及其新种ＥＪ］．动物学报，１９６０，１２（１）：６３—８７． 陆荣茂，柴雪良，董迎辉，等．宽壳全海笋的染色体核型分析ＥＪ］．海峡，２００８，２７（１）：４３～４６． 肖国强，柴雪良，张炯明，等．宽壳全海笋稚贝呼吸代谢及其对若干环境因子适应性的研究［Ｊ］．海洋科学，２００７（９）：２４—２９． 陈竞春，石安静．椭圆背角无齿蚌受精细胞学观察ＩＪ］．水产学报，１９９８，２２（１）：７８—８ｏ． ＬＩ Ｑ，ＯＳＡＤＡ Ｍ，ＫＡＳＨＩＨＡＲＡ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｙｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｐａｅｉｆｉｃａｂａｌｏｎｅ［Ｊ］．Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，６６（４）：７０１—７Ｏ７． 董迎辉，杨爱国，刘志鸿。等．栉孔扇贝正常发育和人工雌核发育二倍体早期胚胎核行为的细胞学观察口］．水产学报，２００６，３０（１）： ２９—３５． 董迎辉，林志华，柴雪良，等．文蛤受精及早期胚胎发育过程的细胞学观察［Ｊ］．动物学报，２００７，５３（４）：７００～７ｏ９． 黄永松．尼罗罗非鱼卵母细胞受精细胞学研究［Ｊ］．动物学报，１９９３，３９（１）：１９—２２． 尹洪滨，孙中武，刘玉堂，等．索氏六须鲶受精细胞学研究口］．东北林业大学学报，２００３，３１（６）：４６—４８． 孙威，尤锋，张培军，等．大菱鲆的受精细胞学研究ＥＪ］．海洋科学，２００５，２９（１２）：７５～８ｏ． 甘光明，张耀光，张贤芳，等．唇鲭受精的细胞学研究［Ｊ］．水生生物学报，２００６，３０（３）：２８４—２９１． 周丽青，杨爱国，刘志鸿，等．栉孔扇贝（旱）×虾夷扇贝（舍）受精细胞学观察［Ｊ］．动物学杂志，２００３，３８（４）：２Ｏ一２３． 任素莲，王德秀，王如才，等．太平洋牡蛎受精过程中的精核扩散与成熟［Ｊ］．海洋湖沼通报，１９９９（１）：３４—３９． 沈亦平，刘汀，姜海波，等．近江牡蛎受精的细胞学研究［Ｊ］．武汉大学学报（自然科学版），１９９５（８）：４８２—４８６． 王昭平，王如才，李洪刚，等．维生素及海水浸泡对牡蛎卵子的体外促熟作用ＥＪ３．海洋湖沼通报，１９９７（２）：７Ｏ一７５． 任素莲，王德秀，绳秀珍，等．栉孔扇贝受精过程的细胞学观察［Ｊ］．海洋湖沼通报，２０００（１）：２４～２９． 沈亦平，刘汀，姜海波，等．合浦珠母贝受精细胞学观察口］．武汉大学学报（自然科学版），１９９３（５）：１１５—１２３． ＢＲＯＷＮ Ｄ Ｂ．Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｄｅｅｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｐｅｒｍ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｕｓｉｎｇ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ ｅｇｇ ｅｘｔｒａｃｔｓ ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｚｏｏｌｏｇｙ，１９８７，２４２：２１ ５ ２３１． 孙慧玲，方建光，王清印，等．泥蚶受精过程的细胞学荧光显微观察［Ｊ］．水产学报，２０００，２４（２）：１Ｏ４—１Ｏ７． 毕克，包振民，黄晓婷，等．菲律宾蛤仔受精及早期胚胎发育过程的细胞学观察［Ｊ］．水产学报，２００４，２８（６）：６２３—６２７． ＷＡＮＧ Ｚ，ＧＵＯ Ｘ，Ａ１ Ｉ ＥＮ Ｓ Ｋ，ｅｔ ａ１ Ａｎｅｕｐｌｏｉｄ Ｐａｃｉｆｉｃ ｏｙｓｔｅｒ（Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ ｇｉｇａｓ Ｔｈｕｎｂｅｒｇ）ａｓ ｉｎｃｉｄｅｎｔａｌｓ ｆｒｏｍ ｔｒｉｐｌｏｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 口］．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ，１９９９，１７３，３４７ ３５７． 何毛贤，林岳光，沈琪，等．合浦珠母贝四倍体诱导过程中非整倍体的产生［Ｊ］．热带海洋，２０００，１９（４）：５９—６４． Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｎ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｂａｒｎｅａ ｄｉｌａｔａｔａ ＤＯＮＧ Ｙｉｎｇ－ｈｕｉ ，ＣＨＡＩ Ｘｕｅ－ｌｉａｎｇ。，ＬＵ Ｒｏｎｇ－ｍａｏ ，ＬＩＮ Ｚｈｉ—ｈｕａ ，ＸＩＡＯ Ｇｕｏ－ｑｉａｎｇ２，Ｚｈａｎｇ Ｊｉｏｎｇ－ｍｉｎｇ。 （１．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｗａｎｌｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｎｒｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｉｎｇｂｏ，３１５１００，Ｃｈｉｎａ；２．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｍａｒｉ—ｃｕｌｔｕｒｅＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｗｅｎｚｈｏｕ，３２５００５，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｂｅｈａｖｉｏｒ ａｎｄ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｈａｐｅ ｄｕｒｉｎｇ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅ— ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｂａｒｎｅａ ｄｉｌａｔａｔａ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅｌｙ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｏｐｔｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ａｎｄ ｐａｒａｆｆｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈ－ ｏｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｕｎｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ ｍａｔｕｒｅ ｅｇｇｓ ｏｆ Ｂａｒｎｅａ ｄｉｌａｔａｔａ ｗｅｒｅ ｐｅａｒ—－ｓｈａｐｅｄ ｏｒ ｅｇｇ—‘ｓｈａｐｅｄ ａｎｄ ｒｅｍａｉｎｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｐｒｏｐｈａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｏｂｖｉｏｕｓ ｇｅｒ—－ ｍｉｎａｌ ｖｅｓｉｃｌｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｌｕｓ，ｗｈｉｌｅ ｔｈｅｉｒ ｓｐｅｒｍｓ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｔｙｐｅ ｏｆ ｆｌａｇｅｌｌｕｍ（４４．０４２±１．１６６）Ｆｍ ｉｎ ｔｏｔａｌ ｌｅｎｇｔｈ）ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｌｌｉｐｔｉｃａｌ ｈｅａｄ．Ａｔ ｗａｔｅｒ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ２４℃，ｓｐｅｒｍｓ ｑｕｉｃｋｌｙ ａｔｔａｃｈｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｇｇ ａｆｔｅｒ ｍｉｘ ｏｆ ｓｐｅｒｍｓ ａｎｄ ｅｇｇｓ．Ｆｒｏｍ ６ ｍｉｎ ｔｏ ９ ｒａｉｎ ａｆｔｅｒ ｉｎｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ，ｇｅｒｍｉｎａｌ ｖｅｓｉｃｌｅ ｇｒａｄｕａｌ— ＪＹ ｇｏｔ ｓｍａｌｌｅｒ ａｎｄ ｂｒｏｋｅｄｏｗｎ ｅｖｅｎｔｕａｌｌｙ．Ｔｈｅ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｄ ｅｇｇｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｐｏｌａｒ ｂｏｄｉｅｓ ａｔ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ２０ｔｈ ｍｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ３０ｔｈ ｍｉｎ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｔ ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｉｖｉｓｉｏｎ， １期 董迎辉等：宽壳全海笋受精和早期胚胎发育过程的细胞学观察 １３１ ｓＤｅｒｍ ｎｕｃ１ｅｕｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｈａｐｌｏｉｄ ｆｅｍａｌｅ ｎｕｃｌｅｕｓ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍａｌｅ ａｎｄ ｆｅ— ｍａ１ｅ Ｄｒｏｎｕｃｌｅｉ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｌｏｏｓｅ ａｎｄ ｉｎｃｏｍｐａｃｔ．Ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｌｅ ｐｒｏｎｕｃｌｅｕｓ ｐｒｅｃｅｄｅｄ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｍａ１ｅ Ｄｒｏｎｕｃｌｅｕｓ． Ａｂｏｕｔ ３５ ｍｉｎ，ｔｈｅ ｍａｌｅ ａｎｄ ｆｅｍａｌｅ ｐｒｏｎｕｃｌｅｉ ｍａｔｃｈｅｄ ｉｎｔｏ ａｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｆｔｅｒ ｔｈｅｉｒ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒｍｅｄ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｅｇｇ．Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｎｕｃ１ｅｕｓ ａｒｒａｎｇｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｔａｐｈａｓｅ ｐｌａｔｅ ｏｆ ｆｉｒｓｔ ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｕｎｔｉｌ ａｂｏｕｔ ５０ ｍｉｎ，ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｐ— ａｒａｔｅｄ ｅｑ ｕａｌｌｙ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｄａｕｇｈｔｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｖｉｄｅｎｔｌｙ ｉｎ ｓｉｚｅ．Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｃｌｅａｖ— ａｇｅ ｗａｓ ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｃｌｅａｖａｇｅ，ｂｕｔ ｔｈｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ａｌｍｏｓｔ ｖｅｒｔｉｃａｌ ｔｏ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｃ１ｅａｖａｇｅ ｆｕｒｒＯＷ． ６ ５～７０ ｍｉｎ ａｆｔｅｒ ｉｎｓｅｍｉｎａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｃｌｅａｖａｇｅ ｈａｓ ｆｉｎｉｓｈｅｄ ａｎｄ ｆｏｒｍｅｄ ｆｏｕｒ ｄａｕｇｈｔｅｒ ｃｅ１１ｓ，ｏｎｅ ｂｉｇ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｓｍａｌ１．Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ，ｔｈｅ ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｈｅｎｏｍｅｎａ ｏｆ ｐｏｌｙｓｐｅｒｍ ａｎｄ ｍｕｌｔｉ— ｓｐｉｎｄｌｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｋｅｖ ｗｏｒｄｓ：Ｂ盘ｒ 以ｄｉｌ口ｔａｔａ；ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ｅａｒｌｙ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ；ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ
