TGF_1及其信号蛋白Smad2_3在大鼠心肌细胞肥大中的作用

・论　著・

βTGFΟ1及其信号蛋白Smad2,3在大鼠

心肌细胞肥大中的作用

覃国辉,黄　俊,马业新(华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科,湖北武汉　430030)βββ探讨转化生长因子Ο　　[摘要]目的　1(transforminggrowthfactorΟ1,TGFΟ1)及其信号蛋白Smad2,3在诱导大鼠心

3

β肌细胞肥大中的作用。方法　培养新生大鼠心肌细胞,用不同剂量TGFΟLeu掺入量,RTΟPCR检测1刺激,检测[H]Ο3

ββ信号蛋白Smad2,3mRNA的表达。结果　不同剂量的TGFΟLeu掺入量,TGFΟ1均能明显增加心肌细胞[H]Ο1增加肥

β大心肌细胞Smad2,3mRNA的表达。结论　TGFΟ1能诱导大鼠心肌细胞肥大,信号蛋白Smad2,3在其中发挥了重要作用。

[关键词]转化生长因子β1;信号蛋白;Smad;心肌;肥大;大鼠

[中图分类号]R542.2　　[文献标识码]A　　[文章编号]1671Ο7562(2003)05Ο0301Ο04

βTheeffectsoftransforminggrowthfactorΟ1

andsignalproteinSmad2,3onratcardiocytehypertrophy

QinGuo2hui,HuangJun,MaYe2xin

(DepartmentofCardiology,TongjiHospitalofTongjiMedicalCollege,

HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030)

βAbstract:Objective　ToinvestigatetheeffectsoftransforminggrowthfactorΟ1andsignalproteinSmad2,3onratcardiocytehypertrophy.Method　Culturedneonatalcardiocyteswereincubatedwithdif2

3

βferentdoseTGFΟLeucineweremeasuredtojudethehypertrophy,RTΟPCR1,theincorporationof[H]Ο

βwasusedtodeterminetheexpressionofSmad2,3mRNA.Results　DiffertentdoseTGFΟ1couldsignifi2cantlyincrease[3H]ΟLeucineincorporation,andtheexpressionofSmad2,3mRNAwasincreasedaswell.

βConclusion　TGFΟ1couldinduceratcardiocytehypertrophy,signalproteinSmad2,3hadimportantroleintheprogression.

βKeywords:transforminggrowthfactorΟ1;signalprotein;Smad;cardicmuscle;hypertrophy;rats

(ModernMedicalJournal,2003,31:301Ο304)

　　在高血压、心肌梗死、瓣膜病、先天性心脏病等许

多心血管疾病的发生发展过程中,心肌肥厚是其共有的病理过程,这是一种基本应答反应,但长期应激导致的持续性病理性心肌肥厚可发展为心脏扩大、充血性心力衰竭和猝死。预防和治疗心肌肥大,对改善心血管疾病的预后,防止心血管突发事件的发生具有重要

ββ意义。在心脏,转化生长因子Ο1(TGFΟ1)既可由心

肌细胞产生,也可由非心肌细胞产生,在心肌肥大反应

β中发挥作用。本试验主要探讨TGFΟ1在大鼠心肌细

胞肥大中的作用以及在心肌肥大过程中的信号转导途

径,为心肌肥大防治提供新的途径。1　材料与方法1.1　材料

动物:出生4d以内的SD(SpragueΟDawley)大鼠,雌雄不拘,由华中科技大学同济医学院医学实验动物中心提供。试剂:胰蛋白酶、5Ο溴脱氧尿苷(bromod2eoxyuridine,Brdu)由Sigma公司提供;胎牛血清、

　　[作者简介]覃国辉(1974-),男,湖北鄂西人,主治医师,在读硕士研究生。

・302・现代医学(ModernMedicalJournal),2003年10月,第31卷　第5期

DMEM培养基、TrizolTM试剂盒由Gibco公司提供;CGΟ3′,扩增片段长477bp;扩增条件:94℃预变性5min,然后94℃45s,50℃45s,72℃45s,72℃延伸7min,共28个循环。大鼠Smad3上游引物为:5′ΟACAGCATGGACGCAGGTTCTΟ3′;下游引物为:5′ΟTCACTGAGGCACTCCGCAAAΟ3′,扩增片段长337bp;扩增条件:94℃预变性5min,然后94℃50s,53℃50s,72℃50s,72℃延伸7min,共32个循环。

βTGFΟRTΟPCR试剂盒由Promage公司提供;[3H]Ο1、

亮氨酸(Leu)由中国原子能科学研究所提供;其他试剂均为国产分析纯。1.2　心肌细胞培养方法

[1]

参考《细胞实验指南》中的方法,在无菌条件下开胸取出心脏,在4℃DΟHanks液中除去心房组织并洗尽残血3次,弃DΟHanks液,将心室组织剪成1mm3大小,加0.1%胰酶5～10ml,37℃吹打消化5min,吸

出上清,加含10%胎牛血清的冷DMEM培养基终止消化,离心(1000r・min-1,5min),弃上清液。同条件下重复消化6～8次,至无肉眼可见组织块为止。分别收集各次的细胞沉淀,加入含20%胎牛血清的DMEM培养基,分装入100ml培养瓶中,在37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中差速贴壁培养1～2h,除去非心肌细胞。吸出未贴壁的心肌细胞,配成1×106ml-1细胞浓度,接种于6孔板,每孔2ml,用含20%胎牛血清的DMEM培养基培养72h,并在最初的2d内加0.1mmol・L-1的Brdu,抑制非心肌细胞的生长。72h后,换无血清培养基继续培养24h,再改用含各种干扰因素的培养基。1.3　试验分组

待原代培养的细胞生长至第4天,将培养的心肌

β细胞随机分为4组,第1组为不含TGFΟ1的对照组,β第2、3、4组分别为含不同剂量的TGFΟ3、10μg・1(1、L-1)试验组。继续培养48h,检测心肌细胞内[3H]ΟLeu掺入量。另将培养的细胞再随机分成5组,用

β30min,1、4、8h,检TGFΟg・L-1)分别刺激15、1(3μ

内参为大鼠βΟactin,其上游引物为5′ΟCCTTCCTGG

GCATGGAGTCCTGΟ3′,下游引物为5′ΟGGAGCAATGATCTTGATCTTCΟ3′,扩增片段长205bp。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。首先将2μg的细胞总RNA转为CDNA,再进行目的基因的PCR扩增,为较准确得到RTΟPCR半定量,分别用内参及目的基因的cDNA产物进行14～38个不同循环数的PCR反应,将不同循环数的PCR产物凝胶电泳,确定

l,各自平台期,再由其决定相应循环数。取终产物5μ1.5%琼脂糖凝胶中电泳,GDS800凝胶成像及分析系

统下扫描分析。以上实验重复3次。

1.6　统计学处理

本试验数据均进行单因素方差分析,以P<0.01为有显著性差异。2　结　　果

3

β2.1　TGFΟLeu掺入的1对培养大鼠心肌细胞[H]Ο

影响(图1)

测心肌细胞Smad2,3mRNA的表达。1.4　[3H]ΟLeu掺入测定细胞蛋白含量

收集细胞前24h按3.7×1010MBq・L-1培养基加入[3H]ΟLeu,收集时先用DΟHanks液冲洗2次,加入0.25%胰蛋白酶消化细胞,将细胞收集于玻璃纤维滤膜上,再用10%三氯乙酸和无水乙醇冲洗。滤膜烘干后置于含4ml闪烁液的液闪杯中测定放射强度。试验均重复3次,单位用dpm・well-1。1.5　RTΟPCR检测信号蛋白Smad2、3mRNA的表达

质量浓度/μg・L-1与对照组比较,3P<0.01

3

β图1　不同浓度TGFΟLec1对大鼠心肌细胞[H]Ο

掺入量的影响

取6孔板细胞,按TrizolTM试剂盒说明书用一步

法提取总RNA,用DNA/RNA测定仪(Beckman公司DU650型)测定RNA浓度和纯度。参考《PCR试验技

[2]术指南》方法,稍作修改进行RTΟPCR。大鼠Smad2上游引物为:5′ΟACTATACCCACTCCATTCCAΟ3′;下游引物为:5′ΟCACTATCACTTAGGCACT

用[3H]ΟLeu掺入的方法可显示心肌细胞蛋白质

β合成功能。结果显示,不同剂量的TGFΟ3、101(1、μg・L-1)均能增加体外培养的新生大鼠心肌细胞[3H]

ΟLeu掺入量,各浓度组与对照组比较均有显著性差异(P<0.01,n=3),但当TGFΟβg・L-1后,1浓度达3μ再增加浓度对[3H]ΟLeu掺入量的影响明显减小。

现代医学(ModernMedicalJournal),2003年10月,第31卷　第5期・303・

β2.2　TGFΟg・L-1)干预不同时间对培养心肌细1(3μ

胞Smad2mRNA表达的影响(图2、3)

M.marker;1.8h组;2.4h组;3.1h组;4.30

min组;5.15min组;6.对照组;7.H2O

M.marker;1.8h组;2.4h组;3.1h组;4.30min组;5.15min组;6.对照组;7.H2O

β图4　TGFΟ1刺激不同时间Smad3mRNA

表达的电泳图

β图2　TGFΟ1刺激不同时间后心肌细胞

Smad2mRNA表达的电泳图与对照组比较,3P<0.01β图5　TGFΟ1刺激不同时间心肌细胞Smad3

与对照组比较,3P<0.01

β图3　TGFΟ1刺激不同时间心肌细胞Smad2

mRNA表达分析

mRNA表达分析

3　讨　　论

β确定Smad2平台期,RTΟPCR法检测TGFΟ1(3μg・L-1)干预不同时间对体外培养的大鼠心肌细胞Smad2mRNA表达的影响。结果显示,控制组有微量

β早期研究认为TGFΟ1主要与心肌细胞外基质形

β成有关,但随着对TGFΟ1认识的深入,发现与心肌细胞的肥大有着密切关系。大量的动物模型和人手术后

的病理标本检测结果[5]提示,无论各种原因导致的心肌肥厚均同时伴随着TGFΟβ1表达的上调。β发现用血管紧张素Ⅱ持续注入TGFΟ1基因敲除后的大鼠,该组大鼠不发生心肌肥厚。本试验

β直接用TGFΟ1以不同剂量刺激心肌细胞,发现TGFΟ

β1能介导心肌细胞肥大,并呈剂量依赖关系。结论与Schultz

[6]

β表达,TGFΟ1干预15min后,Smad2mRNA表达开始上升,为控制组的2.3倍左右,1h后达高峰,为控制

组的4.7倍左右,4h后开始下降,但表达持续至少8h以上。各组与对照组比较,Smad2mRNA表达量均有显著性升高(P<0.01,n=3)。

β2.3　TGFΟg・L-1)干预不同时间对培养心肌细1(3μ胞Smad3mRNA表达影响(图4、5)

β确定Smad3的平台期,RTΟPCR法检测TGFΟ1(3μg・L-1)干预不同时间对体外培养的大鼠心肌细胞Smad3mRNA表达影响。结果显示,控制组仅有微量

βLi等的实验结果[5]相一致,同时更为直接。TGFΟ1介导心肌细胞肥大的机制是诱导了P27kip1基因的表

达,后者再抑制细胞周期蛋白及周期蛋白依赖性激酶来调节细胞周期,使细胞不能从G1期到S期,导致DNA增殖停止,而RNA、细胞浆合成却增加,表现为细胞增殖受抑制但发生肥大。以前的研究证实,TGFΟβ1的细胞内信号传导与我们已知的许多信号途径均β无关,直到Carl等[7]研究发现了TGFΟ1刺激信号从细胞膜向细胞核转移的SMADs信号通路,但该信号途径在心肌肥厚中的表达尚不知晓。根据Carl等[7]

β的研究,与TGFΟ1刺激相关的SMADs信号蛋白有

β表达,TGFΟ1干预15min,Smad3mRNA表达即开始

上升,1h时达高峰,为控制组的6倍左右,4h时出现明显下降,持续至少8h以上。各组与对照组比较Smad3mRNA表达量均有显著性升高(P<0.01,n=3)。

・304・现代医学(ModernMedicalJournal),2003年10月,第31卷　第5期

79Ο82.

[2]迪芬・CW,德维克斯勒・GS.PCR技术实验指南[M].

βSmad2、3(将TGFΟ1刺激信号由细胞膜向细胞核传

导),Smad4(协同Smad2、3的信号传导)和Smad7(抑β制TGFΟ1刺激信号由细胞膜向细胞核传导)。本试验主要研究Smad2、3在大鼠心肌肥大中的信号转导作用。

βTGFΟ1刺激信号从细胞膜向细胞核转移的SMADs信号蛋白在血管平滑肌细胞、成纤维细胞等细

黄培堂,俞炜源,陈添弥,等译.北京:科学出版社,1999.206Ο217.

[3]OMURAT,KIMS,TAKEUCHIK,etal.Transforming

growthfactorbeta1andextracellularmatrixgeneexpressioninisoprenalineinducedcardiachypertrophy:effectsofinhibi2tionofthereninΟangiotensinsystem[J].CardiovascRes,1994,28(12):1835Ο1842.[4]VILLARREALFJ,DILLMANNWH.Cardiachypertro2phyΟinducedchangesinmRNAlevelsforTGFΟbeta1,fi2bronectin,andcollagen[J].AmJPhysiol,1992.262(6Pt2):H1861Ο1866.

[5]LIG,STACEYL.ElevatedinsulinΟlikegrowthfactorΟIand

transforminggrowthfactorΟbeta1andtheirreceptorsinpa2tientswithidiopathichypertrophicobstructivecardiomy2opathy.Apossiblemechanism[J].Circulation,1998,98(19.Suppl):II144Ο149.

[6]SCHULTZJJ,WITTSA,GLASCOCKBJ,etal.TGFΟbeta1mediatesthehypertrophiccardiomyocytegrowthinducedbyangitensinⅡ[J].JClinInvest,2002,109(6):787Ο796.

胞中已得到证实,但在心肌细胞肥大中的作用尚无研

β究。本试验中体外培养大鼠心肌细胞直接用TGFΟ1刺激,发现Smad2、3的mRNA表达水平从15min到1h有明显上升,然后表现为快速下降。这组数据与βSeiya等[8]的结论较为一致,心肌细胞受TGFΟ1刺激后Smad2、3mRNA的表达快速上升,同时表达增加的

βSmad2、3被磷酸化激活转位到细胞核传导TGFΟ1信

号,由于Smad2、3被快速磷酸化而导致了其表达量的

β下降。这说明在大鼠心肌细胞受到TGFΟ1刺激发生肥大的过程中,信号蛋白Smad2、3表达变化与心肌细

胞肥大的发生有着明显的一致性。

β本试验证实,TGFΟ1可以诱导心肌细胞肥大,同

β时其信号蛋白Smad2、3在TGFΟ1刺激信号从细胞膜向细胞核的传导中起重要作用。若加以干涉,可能对

心肌细胞肥大的发生有一定积极影响。

[参考文献]

[1]斯佩克物・DL,戈得曼・RD,莱因万德・LA.细胞实验指南

[M].黄培堂,林福玉,张学敏译.北京:科学出版社,2001.

β[7]CARLΟHENRIKH,KOHEIM,PETERT,etal.TGFΟ

signallingfromcellmembrancetonucleusthroughSMADpro2teins[J].Nature,1997,390(4):465Ο471.

[8]SEIYAK,SEIJIU,KIYOSHIT,etal.EctopicexpressionofSmad7inhibitstransforminggrowthfacotrΟbetaresponsesinvascularsmoothmusclecells[J].LifeSciences,2001,69:21Ο2652.

[收稿日期]2003Ο04Ο10

・论　著・

麻醉前输注不同静脉制剂减轻蛛网膜下腔Ο硬膜外

联合阻滞麻醉后低血压

胡　柳,邱晓东

(东南大学附属中大医院麻醉科,江苏南京　210009)

观察麻醉前输注不同静脉制剂以减轻蛛网膜下腔Ο硬膜外阻滞联合麻醉后低血压的效果。方法　选　　[摘要]目的　

择ASAⅠ-Ⅱ级妇科手术病人60例,随机分为A、B、C3组,每组20例,3组均在麻醉前20～30min预输液500～1000

ml。其中A组输注液体为706代血浆500ml,B组输注贺斯(6%羟乙基淀粉,相对分子质量130000)500ml,C组输注乳

酸钠林格液1000ml。观察蛛网膜下腔Ο硬膜外阻滞联合麻醉后各组收缩压、中心静脉压、心率变化,低血压发生率及麻黄碱的用量。结果　C组在麻醉后收缩压、中心静脉压下降较为明显,低血压的发生率较A、B组明显升高,麻黄碱的用

　　[作者简介]胡柳(1977-),女,江苏泗阳人,住院医师。