《江西畜牧兽医杂￣）２ｏｌ１年第２期 文章编号：１００４—２３４（２０１１）０２—０００６—０３ ・实验研究・ 中图分类号：￥８５２．７２＋３ 文献标识码：Ａ 鸡堆型艾美耳球虫南昌株分离纯化与初步鉴定 吴家斌，李麟，岳蒙蒙 （江西农业大学动物科技学院，江西南昌３３００４５） 摘要：对南昌市场购买的成年鸡肠道，采用饱和盐水漂浮法检查，同时从肠内容物中获取混合球虫卵囊。在制备好的琼脂薄 层的栽玻片上滴加稀释适度的混合卵囊液。在显微镜下用手术刀片小心切割琼脂薄层，达到琼脂薄层上仅剩单一卵囊的 严格要求。把单一卵囊包裹后经口感染雏鸡，又从感染雏鸡粪便中收集大量球虫卵囊待孢子化后再次重度感染雏鸡，掌握 该球虫虫株特征及感染鸡的病理变化。结果表明：单卵囊感染雏鸡，感染率为４Ｏ％；经增殖传代球虫卵囊感染雏鸡虫株，初 步鉴定为鸡堆型艾美耳球虫（Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｖｕｌｉｎａ）。 关键词：堆型艾美耳球虫；南昌株；分离；鉴定 鸡球虫病是由艾美耳属球虫在细胞内寄生引 起的多发、普发的一种疾病，对养鸡特别是集约化 养鸡业危害很大。尤其是对ｌ５～５０日龄雏鸡危害严 重，死亡率可高达８０％以上。病愈的雏鸡，生长受 阻。成年鸡多为带虫而影响产蛋和增重［１］。每年我国 云谱区，熊坊乡某孵化场） １．１．３试验药品。重铬酸钾（ＡＲ级），食用盐（江西盐 业集团公司），琼脂条。 １．１．４试验器械。生化培养箱，离心机，普通天平，内 光源生物显微镜，１ ０００Ｗ双联电炉，数码照相机， 物测微尺和目测微尺，钢铝锅，５００ ｍＬ搪瓷杯，６０ 因球虫病而引起的损失约为２５亿元人民币［２１。目前 我国已经发现９种鸡球虫［３１，其中堆型艾美耳球虫 （Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｖｕｌｉｎａ）有较强致病作用【１］。但在自然情况 下多是混合感染，获得的球虫多是混合球虫种。 为了研究的方便及研究结果的准确性，国内 外学者常应用纯种虫株进行研究，需要基因型纯 ｍＬ三角瓶，６Ｏ目铜筛，２６０目尼纶筛，眼科镊，胶头 吸管，２５０ｍＬ烧杯。 １．２方法 １．２．１饱和食盐水与２．５％重铬酸钾液的制备。以量 筒量取清水１ ｏｏｏｍＬ至钢铝锅内，电炉加热沸腾， 净、单一纯种的卵囊。结果表明，不同球虫地理株在 抗药性和致病力之间都表现出不同的抗药水平，在 倒人食盐３８０ｇ搅拌、溶解、冷却、过滤即为饱和盐 水；以重铬酸钾２５ ｇ溶于１ ０００ ｍＬ清水中即为 ２．５％重铬酸钾液。 分子水平也证明了它们之间有遗传上的差异Ｉ４Ｊ。对 当地球虫种的分离纯化就显得尤为重要。因此，笔 者在借鉴前人方法的基础上ｆ５ １６］，通过实验分离纯 化了球虫卵囊，初步鉴定为鸡堆型艾美耳球虫。现 报告如下： １材料与方法 １．１材料 １．２．２混合球虫卵囊检查、收集培养。取肠内容物于 搪瓷缸内，加少量饱和盐水捣碎搅拌成糊状，再加 ６５ｍＬ饱和盐水搅匀，经６０目铜筛和２６０目尼纶筛 过滤，滤液盛满６０ｍＬ的三角瓶内并成凸形，静置 ２０ ｍｉｎ后载玻片触及凸点迅速翻转，在１６ｘ１６倍显 微镜下观察寻找卵囊，发现大量卵囊后用胶头吸管 吸取上浮液于青霉素空瓶内，兑加２．５％重铬酸钾液 ３ ｍＬ，置３０ｃｃ生化培养箱内培养２４ｈ备用。 １．１．１混合球虫卵囊。从南昌市场购买成年鸡肠道内 容物获取。 １．１．２试验动物。１日龄雄性雏鸡２Ｏ只（购自南昌青 ．１．２．３雏鸡的饲养与管理。雄性雏鸡饲养于杀灭卵囊 ６． 《江西畜牧兽医杂志》２０１１年第２期 的纸盒内或大鼠笼内，饲喂新鲜小鸡料和洁净清 水，每次做到先洗手后饲喂雏鸡，杜绝意外球虫卵 囊感染。 ・实验研究・ 有关文献嘲，确定虫种。 ２结果 ２．１单卵囊感染雏鸡 用琼脂薄层包裹已孢子化卵囊感染１Ｏ只７ Ｅｔ １．２．４单卵囊分离。用天平秤取琼脂条１ ｇ于２５０ｍＬ 烧杯中，添加清水１００ ｍＬ，电炉加热沸腾搅拌成透 明状，趁热用胶头吸管滴加胶冻液于载玻片上，待 冷却后再用胶头吸管取已孢子化的混合球虫卵囊 于成型的琼脂薄层上，置显微镜下逐行寻找球虫卵 龄雏鸡，感染率为４０％，效果较好。 ２．２卵囊的形态 体外鸡堆型艾美耳球虫卵囊形态在不同时间 段有着不同形态特点，刚排出的球虫卵囊内原生质 囊，卵囊密度控制在每个视野约有５～７个，显微镜 观察下用手术刀片细心切割琼脂薄层，使琼脂薄层 上仅留一个球虫卵囊，确认一个卵囊后将该小块琼 脂转移置较大琼脂薄层上并包裹好。 １．２．５单卵囊感染。在助手协同下打开雏鸡喙，将包 裹物经口腔滴加少量清水确认喂服。共感染１Ｏ只７ 日龄雏鸡，记录感染时间，分笼饲养。 １．２．６纯种子代卵囊收集与感染。第４～８ ｄ开始每天 用饱和盐水漂浮法检查雏鸡新鲜粪便，当检查有球 虫卵囊时记录鸡只和排出卵囊时间并开始收集卵 囊。取新鲜雏鸡粪便于５００ ｍＬ搪瓷杯内，杯内装有 一定量的５￣Ｃ清水。待收集一定量粪便后，将搪瓷杯 内原有的清水倾去并捣碎成糊状，加３５０ｍＬ清水混 匀，经６Ｏ目铜筛及２６０目尼纶筛过滤，滤液分装８ 支离心管，每支４５ｍＬ，以２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；留 沉淀物，取少许沉淀物与１０ ｍＬ饱和食盐水搅拌。 搅拌后８支管归装于１支管。倒完沉淀物的７支离 心管分别加１０ｍＬ清水，以２ ０００ｒ／ａｒｉｎ离心５ｍｉｎ， 留含沉淀物离心管内的上液弃沉渣，再兑加清水至 ４５ｍＬ处，以２ ０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清液留沉 淀溶液少许，这样加清水重复离心洗净，最后将富 含卵囊沉淀液从离心管中用吸管吸出移入６０ ｍＬ 三角瓶内 ，加等量５％重铬酸钾液置３０％生化培养 箱内培养。 １．２．７纯种孢子化卵囊感染。胶头吸管吸取含大量卵 囊液，经口感染１２日龄雏鸡１Ｏ只，７ｄ后每天剖检 ２只雏鸡，观察肠道表面病变情况并照相。 １．２．８虫株的鉴定。取少量已孢子化的球虫卵囊液于 载玻片上，在１６ｘ４０倍显微镜下观察发现该球虫卵 囊有几种形态，有无极粒、卵囊及孢子囊残体、斯氏 体等。用显微测微尺测量卵囊大小及孢子囊大小， 测量１００个该卵囊，算出其卵囊大小的平均值及卵 囊形状指数，结合潜隐期及肠道表面病变部位，比对 充满卵囊壁；未孢子化卵囊内原生质聚缩成团形成 单细胞；孢子化卵囊内细胞形成４个孢子囊。 （见图１ ３） 图１ 原生质充满卵囊壁 图２ 原生质聚缩成团 图３ 细胞形成４个孢子囊 ２－３感染雏鸡病理变化 堆型艾美耳球虫多在上表皮层发育，并且同一 发育阶段的虫体聚集在一起；被损害的十二脂肠和 小肠前段出现大量白色小斑点，引起肠道肿胀、出 血。（见图４） ・一７ ・ 《江西畜牧兽医杂志》２０１１年第２期 图４ 堆型艾美耳球虫感染雏鸡病理变化 ２．４雏鸡感染球虫卵囊虫株的鉴定 采用１只感染成功的雏鸡排出的卵囊，经增殖 传代的球虫卵囊感染雏鸡虫株，根据其特征，初步 鉴定为鸡堆型艾美耳球虫ｆ Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｖｕｌｉｎａ）。（见 下表） 表１鸡堆型艾美耳球虫（Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｖｕｌｉｎａ）虫株的鉴定 鸡堆型艾美耳球虫 卵囊特征 卵囊形状 窄卵圆形 卵囊大小（ ｍ２） ２３．２ｘ１７．３—１５．７ｘ１３．１ 平均大小（ ｍ２） １９．５ｘ１５．２ 卵囊颜色 无色 形状指数 １．２８ 卵囊壁 两层、光滑 残体 无孢子卵及卵囊残体 极粒 有１极粒 斯氏体 有斯氏体 完成孢子化时间 １９～２４ｈ 潜隐期 ４ｄ 寄生部位 十二指肠及小肠前段 ３分析与讨论 ３．１虫株分离技术的意义 雏鸡感染球虫在自然情况下多是混合感染。而 以某一种占优势。由于不同的地理株在抗药性和致 病力之间都表现出不同的抗药水平，所以为了研究 的准确性，往往应用纯种株进行研究。球虫的单卵囊 分离技术不但能保证所获得的卵囊为纯种，还可以 进行球虫种类的鉴别和球虫纯种体系的建立。总之。 建立一个便捷可行的纯种分离技术是对球虫深入 研究的前提和保证［６１。 ３．２试验体会 在整个试验过程中，必须进行严格消毒，保证试 验所需的无毒环境；每次离心收集卵囊时，要反复离 心，以洗净盐分避免损坏虫体；离心后，应将离心管 内液面逐层检查，以免由于离心时间不够或转数不 足致使虫体未完全存在于某一液面层而造成卵囊 的丢失；确认琼脂薄层上单卵囊时间不宜过长，否 ・ ８ ・ ・兽＇－写盒研究・ 则因为琼脂干燥而影响观察球虫卵囊，当切割琼脂 薄层时一定要仔细小心；感染时，尽量在雏鸡较饿时 投服，避免由于其进食过多而造成投喂困难；向鸡口 中滴入清水时要避免水从口中溢出，防止卵囊丢失。 单卵囊感染后，鸡粪中排出子代卵囊的时间往往要 迟于最短潜隐期几小时，在潜隐期之前清除粪便，一 般在感染后前４ ｄ无须检查粪便，以免浪费试验用品 和耗费不必要的时间和精力。 ３－３堆型艾美耳球虫虫株的初步鉴定 试验中单卵囊感染１０只雏鸡，受感染为４只。 对其中１只受感染的雏鸡中的球虫卵囊，经复制增 殖分离纯化获得堆型艾美耳球虫虫株。其他３只雏 鸡感染的是什么类型球虫虫株还不得而知，如需掌 握当地雏鸡患球虫种类，试验方法同样要逐一获得 结果。 参考文献： 【１】孔繁瑶．家畜寄生虫学【Ｍ］１版，北京：农业出版社，１９８１： ４１８． 【２】陈汉忠，潘存荣，李桂庆，等．几种常用抗球虫药对鸡球虫 病疗效的评价『Ｊ】．中国兽医学报，２００２，２２（６）：６０４—６０６． ［３］苑淑贤，姚新华，杨金生，等．柔嫩艾美耳球虫纯种的分离 鉴定和致病性观察［Ｊ］．农业与技术，２００５，２５（４）．：９０～９２． ［４ｌ￣Ｕ繁瑶，宁长申，殷佩云．１５株柔嫩艾美尔球虫（Ｅｉｍｅｒ ｉａ ｔｅｎｅｌｌａ）￣ｆ．ｉｆ－种抗球虫药的抗药性调查研究［Ｊ】．北京农业大学 学报，１９９４，２０（３）：３０２～３０８． 【５］谢婷，等．鸡柔嫩艾美耳球虫广西株的分离与鉴／￣－［Ｊ】中国 兽医寄生虫病，２００８，１６（３）：２０２—２０３． 【６】康明，陈刚，等．鸡柔嫩艾美耳球虫西宁株的分离与鉴定［Ｊ］． 安徽农业科学，２００９，３７（１７）：８００１－８００２，８００５． ［７】吴家斌，周吉薇，等．尿素溶液对兔球虫卵囊作用效果对比 试验［Ｊ】．江西农业大学学报，２００６（５）：７７３． ｆ收稿日期：２０１１一Ｏ３—１９） 农业部开展２０１１年 生鲜乳质量安全监测 为加大生鲜乳质量安全监管力度．提高我国 生鲜乳质量安全水平。近日。农业部发布“关于开 展２０１ １年生鲜乳质量安全监测工作”的通知．要 求各省畜牧兽医主管－Ｉ￣．ｆ－Ｉ要切实履行生鲜乳质 量安全监管职能。做好生鲜孔生产、收购和运输 环节监管。确保监测工作取得实效。 （本刊辑）
