婴幼儿轮状病毒两种检测方法的比较
目的：比较轮状病毒（RV）金标免疫层析法（GICA）和电镜法（EM），为实验室合理选择检测方法提供依据。 方法：采用GICA和EM法对120例婴幼儿腹泻标本和100例正常婴幼儿粪便标本进行检测，计算阳性率，并对其检测结果进行统计学分析与比较。结果：EM法的阳性率37.5%（45/120）高于（GICA）法的阳性率33.3%（40/120），差异有统计学意义（Kappa=0.392，χ2=19.，P＜0．01）。两种方法对正常对照组进行检测，结果均为阴性。结论：GICA法和EM法检测婴幼儿粪便中轮状病毒，结果有明显差异。EM法阳性率高，而GICA法低，并且两种方法的假阳性率几乎不存在。
[Abstract] Objective: To carry out the gold standard immunochromatography assay (GICA) and the electron microscopy (EM) to compare the infant rotavirus (RV), which provides basis for a reasonable detecting method for laboratory. Methods: By using the GICA and the EM methods we selected 120 cases of diarrhea in infants and 100 normal samples of stool specimens for testing, and calculated the positive rates. The results were statistically analyzed and compared. Results: The positive rate by EM method (45/120, 37.5%) was higher than that by GICA method (40/120, 33.3%). The differences were significant (Kappa=0.392, χ2=19., P＜0.01). We also detected the normal control group by these two methods, the results were negative. Conclusion: By the GICA and the EM methods to detect the rotavirus in infants, the results are significantly different. The positive rate of EM is high and of the GICA is low. And the false positive rate of the two methods is almost non-existent.
[Key words] Rotavirus; Gold standard immunochromatography; Electron microscopy; Comparison
轮状病毒（RV）是婴幼儿急性胃肠炎（腹泻）尤其是秋冬季腹泻的主要病因[1]，多为A群。新生儿RV感染也较普遍，一般通过粪-口途径传播，且多为无症状感染或轻型腹泻症状，常见于6个月~2岁的婴幼儿。通常使用酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、金标免疫层析法（GICA）和电镜（EM）法来检测病毒，我院主要采用后两种方法。本文通过大量的实验数据，从实验的特异性和敏感度上对两种方法进行比较，以探讨两种不同方法在检测轮状病毒中的价值。现报道如下：
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器与试剂采用轮状病毒快速诊断试剂盒（胶体金法），购自北京万泰生物药业有限公司；120 kV，JEM-1230透射电子显微镜，日本电子株式会社（JEOL）生产。
1.1.2 标本来源本院2008~2009年临床门诊和住院送检的腹泻婴幼儿大便标本120例，男70例，女50例，年龄0~2岁。另设正常对照组100例，年龄0~2岁，男60例，女40例，大便标本正常。
1.2 方法
1.2.1 大便标本的收集在症状出现以后尽快收集粪便标本，用清洁的塑料瓶子装盛。所需标本量约为1 g。如果不立即检测可在2℃~8℃冰箱保存1~2 d。长时间保存需要于-20℃冷冻，使用前彻底解冻并恢复到室温再检测。
1.2.2 GICA法检测在试管中加入0.5 ml稀释液，加适量粪便标本（固体直径约5 mm，液体50 μl）到试管中，使浓度为5%~10%，充分混匀，用滴管取2~3滴加入样品孔，5~10 min判读结果（必须在15 min以内判读结果，强阳性标本可在1~3 min内出现结果）。
1.2.3 EM法检测利用JEM-1230透射电子显微镜，采用直接滴膜常规方法检测。
1.3 统计学方法
采用SPSS 12.0统计软件进行数据处理，组间比较使用χ2检验，计算Kappa值及P值。Kappa值：0.75~1.00为一致性很好，0.40~0.74为一致性一般，0.01~0.39为缺乏一致性[2]。
2 结果
2.1 GICA法检测结果
对120例婴幼儿腹泻标本进行检测，40例阳性，阳性率为33.3%。同时对100例正常婴幼儿标本进行检测，结果全部为阴性。
2.2 EM法检测结果
对120例婴幼儿腹泻标本检测，45例阳性，阳性率为37.5%。同时对100例正常婴幼儿标本进行检测，结果全部为阴性。见图1。
图1电镜下的轮状病毒
2.3 GICA法与EM法比较结果
Kappa=0.392，P＜0.01，提示两种方法缺乏一致性，差异有统计学意义。见表1。
表1 GICA法和EM法检测婴幼儿腹泻标本轮状病毒结果
注：与GICA法比较，Kappa=0.392，χ2=19.，*P＜0.01
3 讨论
轮状病毒是引起婴幼儿腹泻最主要的病原体，腹泻物多为白色米汤样或黄绿色蛋花样稀水便，有恶臭。除引起肠道感染外，还可累及呼吸系统、中枢神经系统及其他系统[3]，心肌也可同时受损[4]，出现心肌酶谱升高及心电图异常[5]。轮状病毒主要由粪-口（fecal-oral）传播而致病，多在冬季和初春流行，此特点可与细菌性痢疾区别。病毒在肠道绒毛细胞的细胞质中增殖、破坏细胞，在脱落坏死的细胞中含有大量病毒随粪便排出。因为绒毛细胞被破坏引起腹泻，造成电解质与水分的损失，所以导致脱水、酸中毒和休克。婴幼儿感染轮状病毒若不加以及时治疗，严重地丧失电解质与体液，可能会有生命危险，在发展中国家是引起婴幼儿死亡的主要原因之一[6]，在发达国家，死亡率虽然比发展中国家低，但是轮状病毒感染占因急性肠胃炎住院人数的30%~60%。因此对轮状病毒及时、准确地快速检测，准确的病原诊断对于有效地治疗、防止滥用抗生素有着十分重要的意义。国内许多医院都在寻求简便快速的诊断轮状病毒感染的实验方法。
本文结果表明，EM法检测轮状病毒的阳性率明显高于GICA法，差异有统计学意义，两种方法对正常对照组的检测结果均为阴性，说明两种方法的假阳性率均很低，甚至为零。
3.1 GICA法的评价
GICA法属于免疫学检测范畴，具有操作简便、快速、直观、可靠、特异性强、重复性好等优点，能满足就诊者急诊检验的需要，是检测婴幼儿RV较合适的方法。不需要特殊仪器设备，市场又有试剂盒出售而深受欢迎[7-8]。因此，许多实验室采用GICA法测定RV的兴趣与需求不断增加。但从以上报道的结果看，其检出的阳性率不甚理想，敏感性低。另外GICA法仅能检测粪便标本中A组轮状病毒抗原，不能检测其他轮状病毒，仅能定性检测，不能定量检测，这些使GICA的应用受到一定的。同时，GICA法在结果观察时有严格的时间要求，必须在15 min以内判读结果。
3.2 EM法的评价
EM是以电子波作为光源，电磁场作透镜，利用电子散射过程产生的信号进行显微成像的大型仪器设备。电镜是诊断轮状病毒的“金标准”，它的优点是：直接、可靠，适合测试超细颗粒甚至纳米颗粒、可直接测量病毒大小和观察病毒的形状，分辨率高，可以看到细胞器的结构、病毒的亚单位以及组成病毒亚单位的大分子结构，几乎不会出现假阳性和误诊，在生物学和医学研究上已普遍应用。但它又存在一定的缺点，所测定的样品量少、代表性差，仪器价格昂贵，技术条件要求高，一般医院不具备条件。因此不适于RV的大规模流行病学调查。
[参考文献]
[1]李毅.儿科疾病诊断标准[M].北京:科学出版社,2001:121.
[2]付荫宇.实用临床科研方法学[M].北京:北京医科大学中国协和医科大合出版社,1990:49-50.
[3]刘珊,卢中朝,张晶.婴幼儿轮状病毒肠炎肝脏损害37例[J].实用儿科临床杂志,2003,18(1):77.
[4]杨丽萍.婴幼儿轮状病毒肠炎合并心肌损害临床分析[J].临床儿科杂志,1999,17(1):59.
[5]王维琼.小儿轮状病毒性肠炎87例临床分析[J].江西医学院学报,2000, 40(1):36.
[6]袁丽娟,钱渊,刘军,等.北京等我国四个地区婴幼儿腹泻轮状病毒VP4、VP7型别的研究[J].病毒学报,1994,10(2):137-144.
[7]郝卫,彭宜君,吴建春,等.几种快速检测新生儿粪便中轮状病毒方法的比较[J].中国优生与遗传杂志,1997,5(6):79.
[8]邱练芬,胡开华,黄开琼,等.四川地区小儿轮状病毒腹泻病原流行分析[J].四川省卫生管理干部学院学报,1997,16(3):147-153.
