第ｌ３卷第２期 ２ ０ １ ７年４月 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．２０９５—０７８０．２０１７．０２．０１３ 南方水产科学 Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖ０１．１３．Ｎｏ．２ Ａｐｒ．，２０１７ 具有结合胆酸盐作用罗ｆ９形鲳 蛋白酶解物 的制备和分子量分布研究 朱晓连 ，陈 华 ，蔡冰娜 ，万 鹏 ，孙恢礼 ，陈得科 ，潘剑宇 （１．中国科学院南海海洋研究所，中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室，广东省海洋药物重点 实验室，广东广州５１０３０１；２．中国科学院大学，北京１０００４９） 摘要：以卵形鲳 （Ｔｒａｃｈｉｎｏｔｕｓ ｏｖａｔｓ）鱼肉为原材料，以酶解产物与胆酸盐的体外结合率为指标，从５种常用食 ｎ品用蛋白酶中筛选最优蛋白酶。进而采用正交法优化酶解条件，以提高酶解产物的胆酸盐结合率，并采用ＧＰＣ 法分析产物中蛋白肽的分子量分布情况。结果表明，胰蛋白酶酶解产物（１００ ｍｇ・ｍＬ。）与胆酸钠、甘氨胆酸钠和 牛磺胆酸钠等３种胆酸盐的体外结合能力均好于其他４种蛋白酶，结合率分别达到４２．１％、３３．５％和３０．１％， 分别相当于降血脂药物考来烯胺散（２Ｏ ｍｇ・ｍＬ ）的７８．３％、７４．４％和７６．８％；经过正交试验优化的制备卵形鲳 蛋白肽的工艺条件为酶解时间２ ｈ，加酶量２ ０００ Ｕ・ｇ～，料液比１：４（ｇ－ｍＬ～、ｐＨ ８、３７℃）。该条件下酶解 产物（２０ ｍｇ・ｍＬ ）对甘氨胆酸钠体外结合率达到同浓度阳性对照物（考来烯胺散）的４８．３％，酶解产物中相对分 子量３ ｋＤ以下的肽类组分占总蛋白水解物的７７．３０％。 关键词：卵形鲳 ；胆酸盐结合；酶解制备；正交优化；分子量分布；肽 中图分类号：Ｓ ９８６．１ 文献标志码：Ａ 文章编号：２０９５—０７８０一（２０１７）０２—０１０１—０８ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｓａｌｔｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｆｒｏｍ Ｔｒａｃｈｉｎｏｔｕｓ ｏｖａｔｕｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ＺＨＵ Ｘｉａｏｌｉａｎ ，ＣＨＥＮ Ｈｕａ ，ＣＡＩ Ｂｉｎｇｎａ ，ＷＡＮ Ｐｅｎｇ ， ＳＵＮ Ｈｕｉｌｉ ，ＣＨＥＮ Ｄｅｋｅ ，ＰＡＮ Ｊｉａｎｙｕ （１．Ｋｅｙ Ｌａｂ．ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏ—ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂ．ｏｆＭａｒｉｎｅ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ，Ｓｏｕｔｈ Ｃｈｉｎａ Ｓｅａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆＯｃｏｅａｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｅｓｅｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｆＳｃｏｉｅｎｃｅｓ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０３０１，Ｃｈｉａ；ｎ ２． 曲ｅ ｏｆＣｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｌｉｔｎｇ １０００４９，Ｃｈｉａ）ｎ Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ ｏｖａｔｅ ｐｏｍｐａｎｏ（Ｔｒａｃｈｉｏｔｎｕｓ ｏｖａｔｓ）ｍｅａｔｎ ａｓ ｒａｗ ｍａｔｅｉｒａｌ ａｎｄ ｔａｋｉｎｇ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ａｎｄ ｂｉｌｅ ｓａｌｔｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒａｔｅ ａｓ ｉｎｄｅｘ，ｗｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｆｉｖｅ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｆｏｏｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｔｈｅｎ ｗｅ ｕｓｅｄ ｏ￣ｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｓａｌｔｓ ａｎｄ ｕｓｅｄ ＧＰＣ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｄｉｓｔｒｉ－ ｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｒｙｐｔｉｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ ｈａｄ ｈｉｇｈｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒａｔｅ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｏｌａｔｅ，ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｃｈｏｌａｔｅ ａｎｄ ｓｏｄｉｕｍ ｔａｕｒｏｃｈｏｌａｔｅ ｂｙ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（１００ ｍｇ‘ｍＬ ） ｗａｓ ４２．１％，３３．５％ａｎｄ ３０．１％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ７８．３％，７４．４％ａｎｄ ７６．８％ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｈｏｌｅｓ－ ｔｙｒａｍｉｎｅ（２０ ｍｇ・ｍＬ ）．Ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｃｈｏｌａｔｅ ｈｙｄｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒａｔｅ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ： 收稿日期：２０１６－０４－２９；修回日期：２０１６－０５一ｌ３ 资助项目：海洋公益性行业专项经费项目（２０１３０５０１８）；海洋区域经济创新示范项目（ＳＺＨＹ２０１２一Ｂ０１－００４，ＧＤ２０１３一Ｂ０３－００１）；“十二五”农 村领域国家科技计划课题（２０１２ＢＡＤ３３ＢｌＯ）；广东省中国科学院全面战略合作项目（２０１２Ｂ０９１００００２５）；广东省科技计划项目 （２０１３Ｂ０９０８００００２，２Ｏｌ５Ｂｏ９０９０４０ｏ３）；广东省自然科学基金项目（２０１４Ａ０３０３１０３５１，２Ｏ１４Ａ０３Ｏ３ｌ０３３８） 作者简介：朱晓连（１９９０一），女，硕士研究生，从事海洋生物资源高值利用与绿色技术研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｘｉａｏｌｉａｎｌ３＠ｍａｉｌｓ．ｕｃａｓ．ａｃ．ａｎ 通信作者：潘剑宇（１９７９一），男，博士，副研究员，从事海洋生物资源高值利用与绿色技术研究。Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｙｐａｎ＠ｓｃｓｉｏ．ａｃ．ｃｎ ｌ０２ 南方水产科学 第１３卷 ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ｔｉｍｅ ｏｆ２ ｈ，ｅｎｚｙｍｅ ａｄｄｉｔｉｖｅｓ ｏｆ２ ０００ Ｕ・ｇ一 ，ｍｅａｌ—ｔｏ—ｗａｔｅｒ ｒａｔｉｏ ｏｆ １：４（ｇ・ｍＬ一 ，ａｔ ｐＨ ８，３７ ｏＣ）．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｃｈｏｌａｔｅ ｈｙｄｒａｔｅ ｂｙ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ（２０ ｍｇ。ｍＬ ）ｗａｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ４８．３％ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｈｏｌｅｓｔｙｒａｍｉｎｅ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｂｅｌｏｗ ３ ｋＤ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｙ— ｓｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｃｃｏｕｎｔｅｄ ｆｏｒ ７７．３０％． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｒａｃｈｉｎｏｔｕｓ ｏｖａｔｕｓ；ｂｉｌｅ ｓａｌｔｓ ｂｉｎｄｉｎｇ；ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ； ｐｅｐｔｉｄｅ 高脂血症（ｈｙｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）是一种常见的由于 血脂代谢或者运转异常而引起的心血管疾病。血 值，深加工空间大。卵形鲳够已经具备了产业化发 展的全部条件，从养殖、加工市场一整套产业链已 经建立 Ｊ，亟待高值化开发利用。 脂含量过高会进一步导致血稠，诱发各种心血管 疾病，高血压、糖尿病也是高脂血症的并发病， 对人类健康造成极大的危害¨ 。目前临床上使 用的化学类降血脂药物虽然疗效确切，但副作用 大，复发率高 ｊ。因此，近年来辅助降血脂功能 性食品的开发成为国内外最热门的领域之一，借 助这些食品调节机体功能，以降低患高脂血症的 风险 Ｊ。通过结合胆酸盐以降低肠道对胆固醇吸 收，是已知食品辅助降血脂的主要机制之一。人 体中约４０％～５０％的胆固醇是通过合成胆汁酸而 被代谓十分解的 Ｊ，胆汁酸的重吸收主要依靠主动 重吸收方式，也就是结合型胆汁酸在回肠部位主 动重吸收 Ｊ。当食物中的成分能结合胆汁酸，把 肠道中消化食物后的胆汁酸更多地带走排出时， 就能促使血液中更多的胆固醇合成胆汁酸来维持 脂类食物正常的消化吸收，从而降低血液中胆固 醇的含量 。 根据文献报道，食物中具有降血脂作用的功能 性成分包括膳食纤维、生物活性肽、脂肪酸、植物 甾醇类、酚类和多糖类物质等 ｍＨ Ｊ。活性肽类不 仅比蛋白质更容易消化吸收，同时还能够调节生理 机能，显示多种生物活性¨ Ｊ。目前，对食源性 生物活性肽的研究主要集中于豆类蛋白肽和糖蛋白 肽¨ Ｊ。ＭＯＲＩＴＡ等 研究报道，大豆蛋白能够 有效抑制胆固醇的肠道吸收，可能与蛋白质较低的 蛋氨酸／甘氨酸比（０．３２３）这一氨基酸特性有关。 ＧＵＤＢＲＡＮＤＳＥＮ等 用含低蛋氨酸／甘氨酸比的蛋 白食物饲养高脂大鼠，发现其能降低大鼠血浆胆固 醇水平。另据报道，海水养殖卵形鲳够（Ｔｒａｃｈｉｎｏ— ｔｕｓ ｏｖａｔｕｓ）鱼肉蛋白中蛋氨酸／甘氨酸比为 ０．３５２ ，稍高于大豆蛋白，提示卵形鲳够蛋白可 能具有良好的胆酸盐结合作用。同时卵形鲳够养殖 成活率高，一般可达９０％以上。其富含高蛋白、 不饱和脂肪酸和多种微量元素，具有较好的食用价 因此，文章利用酶解法制备卵形鲳够蛋白肽， 筛选出合适的蛋白酶并通过正交法优化酶解条件， 以提高产物与胆酸盐的结合效果。 １材料与方法 １．１实验材料 卵形鲳够购自广东广州市黄沙水产市场。实验 试剂包括胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱 性蛋白酶、中性蛋白酶（南宁庞博生物工程有限公 司，食品级）；胆酸钠（国药集团化学试剂有限公 司）；甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、猪胰酶（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）；考来烯胺散（南京厚生药业有限公司）； 其余化学试剂均为分析纯。 相对分子质量分布校正曲线所用标准品：细胞 色素Ｃ（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ），Ｍｗ １２４００；抑肽酶（Ａｐｒｏ— ｔｉｎｉｎ），Ｍｗ ６５１１；杆菌酶（杆菌肽），Ｍｗ １４５０；谷 胱甘肽（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，ＧＳＨ），Ｍｗ ３０７；苯丙氨酸 （Ｐｈｅ），Ｍｗ １６５。 实验仪器包括高速离心机ＴＧＬ．１０Ｂ（上海安 亭科学仪器厂）、微量台式高速离心机ＴＧＷ１６ （长沙英泰离心机仪器有限公司）、真空冷冻干燥 器ＬＧＪ—ＩＯＣ（北京四环科学仪器厂有限公司）、水 浴恒温振荡器ＴＨＺ一８２Ａ（常州亚特实验仪器有限 公司）、离子计ＢＡＮＴＥ９３０（上海般特仪器制造有 限公司）、紫外分光光度计ＵＶ５２００（上海元析仪 器有限公司）、岛津高效液相色谱仪（ＬＣ一２０ＡＴ， ＳＰＤ—Ｍ２０Ａ）。 １．２实验方法 １．２．１ 卵形鲳 蛋白肽的酶解工艺流程 卵彤 鲳够一取肉一匀浆一酶解（取蛋白酶的最佳酶解 ｐＨ和温度 ，酶解条件如表１）一灭酶（１００ ｏＣ，５ ｍｉｎ）一冷却一离心（８ ０００ ｇ・ａｒｉｎ～，１５ ｍｉｎ）一取上 清液浓缩冷冻干燥备用。 第２期 朱晓连等：具有结合胆酸盐作用卵形鲳够蛋白酶解物的制备和分子量分布研究 １０３ １．２．２胆酸盐含量标准曲线的测定 分别吸 １．２．４正交试验方案设计 以酶解产物与甘氨 取配制好的０．４ ｍｍｏ］・Ｌ 胆酸钠（ＳＣ）、甘氨胆酸 胆酸钠体外结合率为指标，采用最优蛋白酶对卵形 鲳够肉进行酶解，将酶解液冷冻干燥，配成２Ｏ ｍｇ・ｍＬ 的溶液进行酶解蛋白与甘氨胆酸钠体外结 钠（ＳＧＣ）和牛磺胆酸钠（ＳＴＣ）标准液０、０．５ ｍＬ、 １．０ ｍＬ、１．５ ｍＬ、２．０ ｍＬ、２．５ ｍＬ于２５ ｍＬ具塞 试管中。加入磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，０．１ ｔｏｏｌ・Ｌ～、 ｐＨ ６．３）至２．５ ｍＬ。然后加入质量分数为６０％的 硫酸溶液７．５ ｍＬ，于７Ｏ℃水浴５０ ｒａｉｎ。冰浴１０ 合率的测定，方法同１．２．３。分别考察酶解时间（２ ｈ、３ ｈ、４ ｈ、５ ｈ、６ ｈ）、加酶量（１ ０００ Ｕ・ｇ～、 ２ ０００ Ｕ・ｇ一 、３ ０００ Ｕ・ｇ～、４ ０００ Ｕ・ｇ～、５ ０００ ａｉｒｎ冷却后分别对同浓度的３种胆酸盐样品进行 全波长扫描（１９０—１ １００ ｎｍ）确定最大吸收波长， Ｕ・ｇ ）和料液比（ｇ・ｍＬ ）（１：２、１：３、１：４、 １：５、１：６）等因素对卵形鲳 酶解产物结合甘氨 胆酸钠能力的影响。选择酶解时间、加酶量、料液 并在此波长处测定上述各浓度标准液的吸光值， 绘制标准曲线，得出３种胆酸盐含量标准曲线方 程 。 比３个因素，每种因素选取３个水平，采用Ｌ。（３ ） 正交试验设计方案以优化酶解工艺条件。 １．２．３ 酶解产物结合胆酸盐能力的测定 分别 １．２．５ 酶解产物分子量分布测定 采用高效 取５种酶解产物（１００ ｍｇ・ｍＬ ）和阳性对照物考来 体积排阻色谱（ＨＰＳＥＣ）法测定卵形鲳够鱼肉酶解 产物的分子量分布，流动相为 （乙腈，含０．１％ 三氟乙酸）：Ｖ（水，含０．１％三氟乙酸）＝２０： 烯胺散（２０ ｍｇ・ｍＬ ）各１ ｍＬ于２５ ｍＬ具塞试管 中。加入１ ｍＬ ＨＣ１（０．Ｏ１ ｔｏｏｌ・Ｌ ），在３７℃水浴 中恒温振荡１ ｈ（模拟胃环境）。随后加入ＮａＯＨ溶 液（Ｏ．１ ｔｏｏｌ・Ｌ ）调节ｐＨ至６．３。每个样品中分别 加入４ ｍＬ配置好的胆酸盐溶液（０．２ ｍｍｏ］・Ｌ～，依 次测定３种胆酸盐），底物空白中加入４ ｍＬ磷酸 ８０，检测波长２２０ ｎｍ，进样体积１０ Ｌ，流速 ０．５ ｍＬ・ｒａｉｎ～，色谱柱ＴＳＫｇｅｌ Ｇ２ＯＯＯＳＷｘＬ（７．８ ×３００ ｍｍ）。分别用流动相配制成质量浓度为１ 盐缓冲液（０．１ ｔｏｏｌ・Ｌ～，ｐＨ ６．３）。随后加入５ ｍＬ 猪胰酶溶液（４×ＵＳＰ，１０ ｍｇ・ｍＬ 模拟肠环境）， 在３７℃水浴恒温振荡１ ｈ。胆盐空白中只加入４ ｍｇ・ｍＬ 的上述不同相对分子质量标准样品溶 液，按一定比例混合后，用孔径０．２２仙ｍ微孔滤 膜过滤后进样，将制备的样品在色谱条件下分 ｍＬ配置好的胆酸盐标准溶液，其余步骤以磷酸盐 缓冲液代替。将恒温振荡后的样品转入离心管，以 １２ ６８０ ｇ・ａｉｒｎ 离心１５ ｍｉｎ。取上清液２．５ ｍＬ于２５ 析，用ＧＰＣ数据处理软件，以相对分子质量的对 数（１ｏｇＭｗ）对保留时间（ ）作图，选择三次回归方 程拟合标准曲线，得到标准品色谱图及分子量回 归方程。分子量回归方程为ｌｏｇＭｗ＝０．Ｏ０２ｘ 一 ｍＬ具塞试管中，加入６０％硫酸７．５ ｍＬ，于７０℃ 水浴５０ ｒａｉｎ。冰浴１０ ｒａｉｎ冷却后在３８７ ｎｍ处测定 ０．１４ｘ ＋２．８５６ｘ一１４．Ｏ１。用峰面积归一法计算 得到相对分子质量的分布情况。 吸光值，由标准曲线求得上清液中胆酸盐的浓 度 。每个样品平行测定３次，进行数理统计。 １．２．６数据分析 分析结果以平均值±标准差 胆酸盐结合率（％）＝（Ｃ。一Ｃ ）／Ｃ。×１００ 式中Ｃ。为胆盐空白的浓度；Ｃ 为上清液中胆 酸盐的浓度。 （ ±ＳＤ）表示。采用ＳＰＳＳ １９．０对数据进行统计 分析。Ｐ＜０．０５为差异显著，Ｐ＞０．０５为差异不显 著。 南方水产科学 ０ＩＩ对 ．１０∞ ｌ ｌ １ Ｏ Ｏ —第１３卷 Ｏ —Ｏ 胆酸钠ＳＣ Ｏ １．６ １．４ １．２ ４ ２ Ｏ ８ ６ ４ ２ Ｏ ４ Ｏ．２ ２００ ３００ ４００ ５００ ６００ ７００ ８００ Ｏ ０．０２ ０．０４ ０．Ｏ６ Ｏ．０８ Ｏ．１０ ０．１２ 波长／ｎｍ ｗａｖｅ ｌｅｎｇｔｈ ｃ／ｍｍｏｌ・Ｌ‘‘ 图１ ３种胆酸盐溶液紫外可见光谱及标准曲线 Ｆｉｇ．１ ＵＶ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕＩｖｅ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｂｉｌｅ ｓａｌｔｓ 馨 ｕＩ１日 ．１０∞ 靠 ２结果与分析 Ｏ １ Ｏ ８ Ｏ ６ ２．１ ３种胆酸盐溶液紫外可见光谱及标准曲线 ３种胆酸盐溶液在近紫外可见光区域（２００～ ７６０ ａｍ）扫描图谱见图１，测得在３８７ ｎｍ处３种胆 酸盐均有最大吸收峰值。胆酸钠的线性回归方程为 Ｙ＝１４．９８７ ｉｘ＋０．０３９ １，相关系数Ｒ ＝０．９９７ ３； 甘氨胆酸钠的线性回归方程为Ｙ＝１３．２３５ ７ｘ＋ ０．０３７ ０，相关系数Ｒ ＝０．９９７ ７；牛磺胆酸钠的线 性回归方程为Ｙ＝１３．０８５ ７ｘ＋０．０３６ ７，相关系数 Ｒ ＝０．９９７ ６。 胰蛋白酶 ｔｒｙｐｓｉｎ 木瓜蜇自酶ｐａｐａｉｎ 菠萝蛋臼酶ｂｒｏｍｅｌａｉｎ 碱性置臼酶ａｌｃａｌａｓｅ 中性盘ｔ３摒考来烯胺散 ｎｃｕｎａｓｅ ｃｈｏｌｅｓｔｙｒａｍｉｎｅ ２．２ ５种蛋白酶酶解蛋白结合胆酸盐能力的比较 ５种蛋白酶酶解蛋白结合胆酸盐能力的比较结 果见图２。５种蛋白酶酶解蛋白与３种胆酸盐均有 图２ ５种蛋白酶酶解液与阳性对照体外结合 ３种胆酸盐能力比较 ５种酶解物质量浓度为１００ ｍｇ・ｍＬ～，阳性对照考来烯胺散 结合能力，结合胆酸钠和甘氨胆酸钠能力较强，结 合牛磺胆酸钠能力较弱。胰蛋白酶酶解蛋白与３种 胆酸盐的体外结合能力均好于其他４种蛋白酶，与 胆酸钠、甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的结合率分别达 到４２．１％、３３．５％和３０．１％。甘氨胆酸钠和牛磺 质量浓度为２０ ｍｇ・ｍＬ‘。；图中各柱形图上小写 英文字母不同者表示差异显著，Ｐ＜０．０５。 Ｆｉｇ．２ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｂｉｌｅ ｓａｌｔｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｉｆｖｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｉｖｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ ｗｅｒｅ １００ ｍｇ・ｍＬ一 ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ２０ ｍｇ・ｍＬ～．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｏｎ ｈｉｓｔｏｇｒａｍ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｇｒｏｕｐ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｉｃａｎｔｆ 胆酸钠都属于结合型胆酸盐，已有文献报道，牛磺 胆酸钠是属于较难被结合的结合型胆酸盐 ，而 ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｆ尸＜０．０５１． 结合牛磺胆酸钠能力强的物质往往对人体中含量最 大的甘氨胆酸盐的结合能力更强＿２ ，所以选择酶 解蛋白与甘氨胆酸钠体外结合率为指标进行酶解工 艺优化试验。 ２．３酶解工艺优化单因素试验 的影响 加酶量３ ０００ Ｕ・ｇ～、料液比１：４、温 度３７℃、ｐＨ ８，反应时问２ ｈ、３ ｈ、４ ｈ、５ ｈ、６ ｈ。酶解时间与结合甘氨胆酸钠能力的关系见图３。 在一定范围内，随着酶解时间的增加，酶解物与甘 ２．３．１ 酶解时间对酶解产物结合甘氨胆酸钠效果 氨胆酸钠的结合率减小，第２小时达到最大。过长 第２期 朱晓连等：具有结合胆酸盐作用卵形鲳够蛋白酶解物的制备和分子量分布研究 ｌ６ １５ ｌ４ １３ ｌ２ 凳呈－ 姆量ｌｏ ．堇９ ８ ７ ６ ６ 酶解时间，ｈ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ 图３ 酶解时间对与甘氨胆酸钠结合率的影响 Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｔｉｍｅ ｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｃｈｏｌａｔｅ 霄．Ｉ 盘一口ｌＩ—ｏ口』，蓄２ 的酶解时间可能使能与甘氨胆酸钠结合的物质分 ８ ７ ６ ５ ４ ３ ２ ｌ Ｏ ９ ８ ７ ６ 解，导致结合率下降。所以，酶解时间较优条件为 ２—４ ｈ。 ２．３．２加酶量对酶解产物结合甘氨胆酸钠效果的 影响 反应时间４ ｈ，料液比１：４、温度３７℃、 ｐＨ ８。加酶量选择１ ０００ Ｕ・ｇ～、２ ０００ Ｕ・ｇ～、 ３ ０００ Ｕ・ｇ～、４ ０００ Ｕ・ｇ 和５ ０００ Ｕ・ｇ。。。加酶量 与结合甘氨胆酸钠能力的关系见图４。在一定范围 内，随着加酶量的增加，酶解物与甘氨胆酸钠的结 合率先增大后减小，加酶量为２ ０００ Ｕ・ｇ 时达到 最大，此时继续增加加酶量，可能使能与甘氨胆酸 钠结合的酶解蛋白继续酶解成较小的肽或其他游离 氨基酸。所以选择加酶量为２ ０００ Ｕ・ｇ 为较优工 艺条件。 ２．３．３料液比对酶解产物结合甘氨胆酸钠效果 的影响 反应时间４ ｈ、加酶量３ ０００ Ｕ・ｇ～、 温度３７℃、ｐＨ ８。料液比１：２、１：３、１：４、 １：５和１：６。料液比与结合甘氨胆酸钠能力的 关系见图５。随着料液比的降低酶解物与甘氨胆 酸钠的结合率先增长后趋于平缓，料液比为１：４ 时酶与底物反应以趋于平衡状态。所以选择料液 比为１：４。 ２．４酶解工艺优化的正交试验结果 在单因素试验结果基础上，采用三因素三水平 正交试验对胰蛋白酶水解条件进行优化，以酶解物 与甘氨胆酸钠的结合率为指标，确定胰蛋白酶最佳 酶解条件。正交设计和结果见表２。 祷 姆 １ ０００ ２０００ ３ ０００ ４０００ ５ ０００ 加酶量／Ｕ・ｇ ｅｎｚｙｍｅ ｄｏｓａｇｅ 图４加酶量对与甘氨胆酸钠结合率的影响 Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｃｈｏｌａｔｅ 瓣 Ⅱ 姆 １：２ ｌ：３ １：４ １：５ １：６ 料液比 ｍｅａ１．．ｔｏ ．ｗａｔｅｒ ｒａｔｉｏ 图５料液比对与甘氨胆酸钠结合率的影响 Ｆｉｇ．５ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅａｌ－－ｔｏ－－ｗａｔｅｒ ｒａｔｉｏｓ ｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｇｌｙｃｏｃｈｏｌａｔｅ 表２直观极差分析结果显示，胰蛋白酶酶解 时影响酶解产物结合甘氨胆酸钠能力的因素依 次为加酶量（Ｕ・ｇ ）＞料液比＞酶解时间（ｈ）。 在ｐＨ ８，温度为３７℃的条件下，利用胰蛋白酶 酶解的最优组合为Ａ Ｂ Ｃ ，即酶解时间２ ｈ、酶 用量２ ０００ Ｕ・ｇ～、料液比１：４。表３方差分析 结果表明，加酶量对酶解产物结合甘氨胆酸钠 有显著性影响（Ｐ＜０．０５）。在该工艺条件下， 酶解产物与甘氨胆酸钠体外结合率为２１．７３％， 结合活性相当于同浓度降血脂药物考来烯胺散 的４８．３％，显示出卵形鲳 酶解蛋白肽潜在的 降血脂活性。 １０６ 南方水产科学 第１３卷 表３方差分析表 Ｔａｂ．３ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ 注： ．Ｐ＜０．０５为差异显著 Ｎｏｔｅ：￥．Ｐ＜０．０５ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｓｉｇｎｉｉｃａｎｔｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ． ２．５酶解产物的分子量分布 图６为优化条件下卵形鲳够鱼肉酶解产物的 ＨＰＳＥＣ图谱。由表４可以看出水解物大部分为相 对分子质量在３ ｋＤ以下的小分子肽，３ ｋＤ以下的 组分占７７．３０％。相关研究指出，分子量在３ ｋＤ 以下的多肽含有多种生物活性，如降低胆固醇、抗 氧化、降血压、免疫调节等 …，这些活性肽在功 能性食品中有着广阔的应用前景。因此，下一步将 对卵形鲳 鱼肉酶解产物中不同肽段进行进一步的 图６卵形鲳 酶解产物分子量分布图 Ｆｉｇ．６ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｆ ｏｖａｔｕｓ 细胞和动物活性筛选，探讨其在功能性食品方面的 潜在利用价值。 第２期 朱晓连等：具有结合胆酸盐作用卵形鲳 蛋白酶解物的制备和分子量分布研究 表４卵形鲳鳐酶解产物不同肽段相对分子质量的分布情况 １０７ Ｔａｂ．４ Ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｆ ｏｖａｔｕｓ ｅｒａｌｓ：ｆｏｒｍ ａｎｄ ｆｕｎｃｉｔｏｎｓ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ，２００９，１４：２５８４— ３结论 经实验筛选，在５种常用食品工业用蛋白酶中 优选出胰蛋白酶作为制备卵形鲳够蛋白肽的蛋白 ２５９８． 『７］ＭＡＬＨＡＭ Ｓ Ｂ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｉｓｋ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓ． ｔｅｒｏｌ ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｄｒｕｇｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｔ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｅｏｌ，２０１６，２７：６２－６９． 酶。 以酶解产物与甘氨胆酸钠的体外结合率为指 标，经正交试验发现，影响酶解产物结合甘氨胆酸 钠能力的因素依次为加酶量＞料液比＞酶解时间。 其中加酶量对酶解产物结合甘氨胆酸钠能力有显著 性影响（Ｐ＜０．０５）。正交试验得出的最佳酶解条件 为：酶解时间２ ｈ、酶用量２ ０００ Ｕ・ｇ。。、料液比 １：４（ｐＨ ８，３７℃）。该条件下酶解产物与甘氨胆 酸钠体外结合率为２１．７３％，相当于同浓度降血脂 药物考来烯胺散的４８．３％，显示出卵形鲳 酶解 蛋白肽在辅助降血脂方面的潜力。ＧＰＣ分析显示 酶解产物中主要为相对分子量３ ｋＤ以下的肽类， 占总蛋白水解物的７７．３０％。 该研究成果可为开发利用海洋鱼蛋白制备辅助 降血脂产品提供理论和技术参考，因研究评价方法 体外结合试验为化学方法，缺少必要的生物学评 价，因此，需进行进一步的细胞和动物模型活性研 究，完善其在细胞和动物模型中的作用效果。 参考文献： ［１］ＰＩＳＣＩＯＴＩ＇Ａ Ｌ，ＢＥＲＴＯＬＩＮＩ Ｓ，ＰＥＮＤＥ Ａ．Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｏｋｅ ａｎｄ ｓｔａｔｉｎｓ［Ｊ］．ＣｕｒｔＶａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１５，１３（２）：２０２－２０８． ［２］ＥＮＥ—ＩＯＲＤＡＣＨＥ Ｂ，ＰＥＲＩＣＯ Ｎ，ＢＩＫＢＯＶ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｃｈｍｎｌｃ ｋｉｄ－ ｈｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｉｓｋ ｉｎ ｓｉｘ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｗｏｄｄ（ＩＳＮ— ＫＤＤＣ）：ａ ＣＲＯＳＳ—ｓｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ Ｇｌｏｂ Ｈｅａｌ，２０１６，４ （５）：３０７—３１９． ［３］ＺＨＥＬＹＡＺＫＯＶＡ—ＳＡＶＯＶＡ Ｍ，ＧＡＮＣＨＥＶＡ Ｓ，ＳＩＲＡＫＯＶＡ Ｖ． Ｐｏｔｅｎｔｉｌａ ｓｔａｔｉｎ—ｄｒｕｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉ— ｃａｎｃｅ［Ｊ］．ＳｐｒｉｎｇｅｒＰｌｕｓ，２０１４，３（１）：１６８－１７５． 【４］ＨＩＬＬ Ａ Ｍ，ＦＬＥＭＩＮＧ Ｊ Ａ，ＫＲＩＳ—ＥＴＨＥＲＴＯＮ Ｐ Ｍ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｄｉｅｔ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｃａｒｄｉｏ－ ｖａｓｃｕｌｒａ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃａｒｄｉｏｌ，２００９，２４（５）：４３３＿４４１． ［５］ＨＯＷＡＲＤ Ａ，ＵＤＥＮＩＧＷＥ Ｃ Ｃ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｆｏｏｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｙｐｏｌｉｐｉｄａｅｍｉａ【Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｆｕｎｃｔ，２０１３，４（１）：４０－５１． ［６］ＨＯＦＭＡＮＮ Ａ Ｆ．Ｔｈｅ ｅｎｔｅｍｈｅｐａｔｉｃ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｌｅ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｍａｉｎ－ ［８］贾弘裎，冯作化．生物化学与分子生物学［Ｍ］．２版．北京： 人民卫生出版社，２０１０：２８２－２８７． ［９］ＤＡＷＳＯＮ Ｐ Ａ，ＫＡＲＰＥＮ Ｓ Ｊ．Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆｂｉｌｅ ａｃｉｄｓ［Ｊ］．Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ，２０１５，５６（６）：１０８５—１０９９． ［１０］陈继承，何捷，何国庆．降血脂功能食品研究进展［Ｊ］．食 品科学，２０１１，３２（２３）：３３３－３３８． ［１１］麦紫欣，关东华，林敏霞，等．膳食纤维降血脂作用及其机 制的研究进展［Ｊ］．广东微量元素科学，２０１１，１８（１）：１１— １６． ［１２］郑海杰，姜绍通，庞敏，等．不同植物甾醇脂肪酸酯降血脂 效果的比较研究［Ｊ］．营养学报，２０１２，３４（２）：１８６—１８８． ［１３］ＨＯＳＯＭＩ Ｒ，ＦＵＫＵＮＡＧＡ Ｋ，ＡＲＡＩ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｆｉｓｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅ— ｃｒｅａｓｅｓ ｓｅｒｕｍ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ｒａｔｓ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｎｄ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ［ｊ］．Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ，２０１１，７６（４）：Ｈ１１６・ Ｈｌ２１． ［１４］ＴＩＬＬＡＮＤＥＲ Ｖ，ＢＪＯＲＮＤＡＬ Ｂ，ＢＵＲＲＩ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｆｉｓｈ ｏｉｌ ａｎｄ ｋｒｉｌｌ ｏｉｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｌａｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｌｉｐｉｄ ｃａｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｎｕｔｒ Ｍｅｔａｂｏｌ，２０１４，ｌ１（１）： ２Ｏ＿３６． ［１５］ＳＩＳＴＬＡ Ｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ—ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｏ／ｓ－ｃｓａｅｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｈｔ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ， ２０１３，３８４（１／２）：２９－３８． ［１６］ｕ Ｈ，ＡＬＵＫＯ Ｒ Ｅ．Ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｏｒｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍｕｈｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｐｅａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ［Ｊ］．Ｊ Ａ ｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２０１０，５８（２１）：１１４７１—１１４７６． ［１７］ＡＧＹＥＩ Ｄ，ＰＯＴＵＭＡＲＴＨ１ Ｒ，ＤＡＮＱＵＡＨ Ｍ Ｋ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｍ］．Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ： Ｗｉｌｅｙ—Ｂｌａｅｋｗｅｌｌ，２０１５：４８３－５０５． ［１８］ＨＯＩＥ Ｌ Ｈ，ＧＵＬＤＳＴＲＡＮＤ Ｍ，ＳＪＯＨＯＬＭ Ａ，ｅｔ １ａ．Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ ｌｏｗｅｒｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｏｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｎｏｎｄｅｎａｔｕｒａｔｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ａｄｖ Ｔｈｅｒ，２００７，２４（２）：４３９－４４７． ［１９］ＭＯＲＩＴＡ Ｔ，ＯＨ—ＨＡＳＨＩ Ａ，ＴＡＫＥＩ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ—ｌｏｗｅｒ－ ｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ，ｐｏｔａｔｏ ａｎｄ ｒｉｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｐｅｎｄ ｏｌｌｔｈｅｉｒｌｏｗ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｆｅｄ ａ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ—ｆｒｅｅ ｐｕｒｉｉｆｅｄ ｄｉｅｔ［Ｊ］． Ｊ Ｎｕｔｒ，１９９７，１２７（３）：４７０－４７７． ［２０］ＧＵＤＢＲＡＮＤＳＥＮ Ｏ Ａ，ＷＥＲＧＥＤＡＨＬ Ｈ，ＬＩＡＳＥＴ Ｂ，ｅｔ １ａ．Ｄｉ— ｅｔａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｈｉ ｇｈ ｉｓｏｆｉａｖｏｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｒ ｌｏｗ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ—Ｓｌｙ— ｃｉｎｅ ａｎｄ ｌｙｓｉｎｅ—ａｒｇｉｎｉｎｅ ｒａｔｉｏｓ ａｒｅ ｈｙｐｏｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌａｅｍｉｃ ａｎｄ ｌｏｗｅｒ ｈｔｅ ｐｌｓａｍａ ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｍａｌｅ Ｚｕｃｋｅｒ ｆａ／ｆａ ｒａｔｓ［Ｊ］．Ｂｒｉｔ Ｊ １０８ 南方水产科学 第１３卷 Ｎｕｔｒ，２００５，９４（３）：３２１－３３０． ［２１］戴梓茹，钟秋平，林美芳，等．金鲳鱼营养成分分析与评价 ［Ｊ］．食品工业科技，２０１３，３４（１）：３４７—３５０． ［２２］韦栋，李玉壮，李英．卵形鲳鳄网箱养殖与病害防治技术 ［Ｊ］．当代水产，２０１３（６）：８７． ［２３］刘锡强，马学坤，刘康，等．华南地区金鲳鱼养殖报告［Ｊ］． 当代水产，２０１４（２）：２６－２９． ［２４］ＪＥ Ｊ Ｙ，ＫＩＭ Ｓ Ｙ，ＫＩＭ Ｓ Ｋ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉ－ ｔｙ ｏｆ ｈｏｋｉ ｆｒａｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｕｓｉｎｇ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２００５，２２１（１／２）：１５７—１６２． ［２５］辛勋，陆红云．紫外分光光度法测定速效伤风胶囊中胆酸含 量［Ｊ］．中国药业，２０００，９（１）：３６－３７． ［２６］吴继美．粮食水溶性蛋白结合胆酸盐能力及胆酸盐免疫检测 方法的研究［Ｄ］．广州：暨南大学，２０１４：２０－２１． ［２７］ＫＡＨＬＯＮ Ｔ Ｓ，ＭＩＬＣＺＡＲＥＫ Ｒ Ｒ，ＣＨＩＵ Ｍ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｋａｌｅ，ｍｕｓｔａｒｄ ｇｒｅｅｎｓ，ｂｒｏｃｃｏｌｉ，ｃａｂｂａｇｅ ａｎｄ ｇｒｅｅｎ ｂｅｌｌ ｐｅｐｐｅｒｉｍｐｒｏｖｅｓｗｉｔｈｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｃｏｏｋｉｎｇ［Ｊ］．Ｖｅｇｅｔｏｓ，２０１２， ２５（２）：２９・３６． ［２８］ＳＡＥＫＩ Ｔ，ＫＵＲＯＤＡ Ｔ，ＭＡＴＳＵＭＯＴＯ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｙｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｏｎ ｔａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｙ ｍｏｕｓｅ ｉｌｅａｌ ａｎｄ ｈｅｐａｔｉｃ ｓｏｄｉｕｍ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｂｉｌｅ ａｃｉｄ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｅｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２００２，６６（２）：４６７４７０． ［２９］ＳＴＯＲＹ Ｊ Ａ，ＫＲＩＴＣＨＥＶＳＫＹ Ｄ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｂｉｌｅ—ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｂｉｌｅ—ｓａｌｔｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ｓｅｖｅｒａｌ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｉｆｂｅｒ［Ｊ］．Ｊ Ｎｕ— ｔｒ，１９７６，１０６（９）：１２９２—１２９４． ［３０］ＭＵＬＬＥＲ Ｎ Ｐ，ＳＣＨＯＬＺ—ＡＨＲＥＮＳ Ｋ Ｅ，ＲＯＯＳ Ｎ，ｅｔ １ａ．Ｂｉｏａｃ— ｒｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｆｏｏｄｓ：ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｅａｌｔｈ ｅｆｆｅｃｔｓ ［Ｊ］．Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｔｒ，２００８，４７（４）：１７１－１８２．
