生物化学教案-第二章蛋白质的结构与功能-6学时

授课题目（章、节或主题）： 第二章 蛋白质化学1 授课类型（请打√） 授课方法（请打√） 授课资源（请打√） 教学目的： 1.了解蛋白质的分类； 2.掌握蛋白质的化学组成； 3.掌握蛋白质的结构与功能； 4.熟悉蛋白质的理化性质； 教学方法、手段： 多媒体技术与板书并用 教学重点、难点： 重点：20种氨基酸的分子式、三字母缩写、分子式。 难点：蛋白质的结构。 教学内容及过程设计 思想教育： 配合学校的培养任务，完成知识、技能等显性职业素养的培养。职业行为和职业技能等显性职业素养比较容易通过教育和培训获得。学校的教学及各专业的培养方案是针对社会需要和专业需要所制订的。旨在使学生获得系统化的基础知识及专业知识，加强学生对专业的认知和知识的运用，并使学生获得学习能力、培养学习习惯。因此，大学生应该积极配合学校的培养计划，认真完成学习任务，尽可能利用学校的教育资源，包括教师、图书馆等获得知识和技能，做为将来职业需要的储备 一、新课导入（用举例的方法来阐述蛋白质在生命中的作用） 蛋白质是生物体的基本组成成分之一，也是含量最丰富、功能最多的高分子物质，约占人体固体成分的45％。蛋白质是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。 蛋白质在生命活动中执行着多种功能，如催化功能（酶）；调节功能（部分激素是蛋白质、非蛋白激素的合成离不开酶的催化、激素受体是蛋白质、基因的也离不开蛋白质）；运输功能（血红蛋白、载体、转运蛋白等）；运动功能（肌肉收缩是实现躯体运动、血液循环、呼吸、胃肠蠕动的基础，都依赖有收缩功能的蛋白）；防御功能（抗体和补体）；应激功能（神经的传导和大脑的思维离不开蛋白质）；机械支持功能（皮肤、结缔组织、骨骼的胶原蛋白）；物质代谢；细胞补充内容和时间分配 （10分钟） 新课导入 10分钟 - 1 -

课时安排 授课时间 2 第2周 理论课□√ 研讨课□ 习题课□ 复习课□ 其他□ 讲授□√ 讨论□ 示教□ 自学辅导□ 其他□ 多媒体□√ 模型□ 实物□ 挂图□ 其他□ 信息传递；个体生长发育；组织修复等。 二、新课讲授 第一节 蛋白质分子组成 一、蛋白质结构与功能概述 蛋白质是生命的表征，哪里有生命活动哪里就有蛋白质 1.酶：作为酶的化学本质，温和、快速、专一，任何生命活动之必须，酶的另一化学本质是RNA，不过它比蛋白质差远了，种类、速度、数量。 2.免疫系统：防御系统，抗原（进入“体内”的生物大分子和有机体），发炎。 细胞免疫：T细胞本身，分化，脓细胞。 体液免疫：B细胞，释放抗体，导弹，免疫球蛋白（Ig）。 3.肌肉：肌肉的伸张和收缩靠的是肌动蛋白和肌球蛋白互动的结果，体育生化。 4.运输和储存氧气：Hb和Mb。 5.激素：含氮类激素，固醇类激素。 6.基因表达调节：操纵子学说，阻遏蛋白。 7.生长因子：EGF（表皮生长因子），NGF（神经生长因子），促使细胞。 8.信息接收：激素的受体，糖蛋白，G蛋白。 9.结构成分：胶原蛋白（肌腱、筋），角蛋白（头发、指甲），膜蛋白等。生物体就是蛋白质堆积而成，人的长相也是由蛋白质决定的。 10.精神、意识方面：记忆、痛苦、感情靠的是蛋白质的构象变化，蛋白质的构象分类是目前热门课题。 11.蛋白质是遗传物质？只有不确切的少量证据。如库鲁病毒，怕蛋白酶而不怕核酸酶。 二、构成蛋白质的元素 构成蛋白质的主要元素有C、H、O、N、S 5种，其中N元素的含量很稳定，16％，因此，测定样品中氮元素的含量就能算出蛋白质的量。 （一） 蛋白质（Protein）的元素组成及其特点。 主要C、H、O、N、S。其他P、Fe、Cu、Zn、Mn、Co、Mo、I。 蛋白质含氮量平均为16％，而且大部分氮元素存在在蛋白质中 测定生物样品含氮量，可推算出蛋白质大致含量。 每克样品含氮克数×6.23×100＝100克样品中蛋白质含量（g％） （二）蛋白质的基本组成单位是氨基酸。 连在羧基上的C称为α－碳原子，为不对称碳原子（甘氨酸除外），不同的氨基酸其侧链（R）各异。 根据其侧链的结构和理化性质分为四类： 1．非极性疏水性氨基酸 侧链基团有甲基、苯环等疏水基团。侧链彼此连结形成疏水键，是蛋白质三级结构中数量最多的次级键。 甘、丙、缬、亮、异亮、苯丙、脯。（7种） 2．极性中性氨基酸 侧链基团有羟基、酚基、巯基和酰胺基等极性亲水基团。 20分钟 20分钟 - 2 -

色、丝、酪、半胱、蛋、苏、天冬酰胺、谷氨酰胺。（8种） 3．酸性氨基酸 侧链上有羧基，在中性水溶液中电离出H＋而带负电荷。 天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu） 4．碱性氨基酸 侧链氨基、胍基和咪唑基可接受H＋而带正电荷。 赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、组氨酸（His） 脯氨酸与半胱氨酸较为特殊。脯氨酸属亚氨基酸，亚氨基能与另一羧基形成肽键；N在环中，移动的自由度受到，处于多肽链中时，往往使肽链走向形成折角。两个半胱氨酸脱氢以二硫键相连形成胱氨酸。在蛋白质分子中二硫键（共价键）是连接肽链内或肽链间的主要桥键，造成肽链分支或成为环状。 蛋氨酸又称甲硫氨酸。 三、蛋白质的结构层次 1．一级结构：蛋白质分子中氨基酸的线性排列顺序。 2．二级结构：蛋白质主链局部有规则的空间排布方式。 3．三级结构：肽链在空间的折叠和卷曲形成的形状，所有原子在空间的排布。 4．四级结构：多条肽链之间的作用。 四：蛋白质功能上的多样性是由其结构的千差万别所决定的。只有在深入了解蛋白质结构的基础上才能更透彻了解蛋白质的功能。 150万种生物中，有1010～1012种蛋白质及1010种核酸、人体蛋白质有106种。 四、氨基酸的理化性质 1．两性解离及等电点 （1）两性解离 氨基酸含有碱性的α-氨基和酸性的α-羧基，在酸性溶液中与质子结合成带正电荷的阳离子，在碱性溶液中与OH－结合，失去质子成为带负电荷的阴离子。氨基酸是两性电解质，具有两性解离特性。 （2）pI 氨基酸解离方式取决于所溶液的pH，解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等成为兼性离子，呈电中性时的溶液pH称为该氨基酸的等电点。 氨基酸的pI是由α-羧基和α-氨基的解离常数的负对数pK1和pK2决定的。pI =1/2（pK1＋pK2） （Glu：3.22； Lys：9.74） 2.紫外吸收性质 参与蛋白质组成的20种氨基酸，在可见光区域都没有光吸收，但在远紫外区（<220nm）均有光吸收。在近紫外光区域（220－300nm）只有酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）有吸收光的能力。因为它们的R基含有苯环共轭双键系统。 测定蛋白质溶液在280nm波长处光吸收值，可快速、简便分析溶液中蛋白质含量。 3．茚三酮反应 在氨基酸的分析化学中，具有特殊意义的是氨基酸与茚三酮的反应。茚三酮在弱酸性溶液中与α-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后茚三酮与反应物——氨和还原茚三酮发生作用，生成蓝紫色化合物，最大吸收峰在570nm波长处。茚三酮显色可用于氨基酸的定性或定量测定。 10分钟 5分钟 5分钟 - 3 -

五、蛋白质的分类 （一） 根据蛋白质的组成成分 1． 单纯蛋白质 只含氨基酸。 2．结合蛋白质 还含非蛋白部分（辅基），以共价键与蛋白质结合。如色素、寡糖、脂类、磷酸、金属离子、核酸。 （二）根据蛋白质的形状 1．纤维状蛋白质：分子长轴的长度比短轴长10倍以上。纤维状的结构蛋白质，难溶于水。 2．球状蛋白质：球形或椭圆形的功能蛋白质，可溶于水。 小结：重复所学主要内容并指出重点难点。 1、蛋白质在生命中的作用； 2、蛋白质的分子组成（掌握）； 3、氨基酸的分类（重点、难点）； 4、氨基酸的理化性质； 5、蛋白质的分类。 思考题、作业题、讨论题： 1、蛋白质的理化性质。 2、20种氨基酸的结构特点。 3、氨基酸的理化性质及分类。 课后总结分析：

授课题目（章、节或主题）： 第二章 蛋白质化学2 授课类型（请打√） 授课方法（请打√） 授课资源（请打√） 教学目的： 1.掌握蛋白质一级结构和功能的关系； 2.掌握蛋白质的空间结构与功能的关系； 3.掌握蛋白质的理化性质； 4.了解蛋白质分离纯化技术。 教学方法、手段： 多媒体和板书 课时安排 授课时间 2 第3周 理论课□√ 研讨课□ 习题课□ 复习课□ 其他□ 讲授□√ 讨论□ 示教□ 自学辅导□ 其他□ 多媒体□√ 模型□ 实物□ 挂图□ 其他□ - 4 -

教学重点、难点： 1..蛋白质的空间结构与功能的关系； 2..蛋白质的理化性质； 教学内容及过程设计 一、课程回顾 上节课我们学习的内容： 1、 蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构、四级结构。 2、 蛋白质结构与功能之间的关系。 二、新课讲授 蛋白质结构与功能的关系 一、蛋白质一级结构与功能的关系 （一）一级结构是空间构象的基础 核糖核酸酶的变性和复性实验是一个很有说服力的证明。 8M尿素 透析去尿素 天然RNA酶 →→→→→→ 变性RNA酶 →→→→→→ 复性RNA酶 β-巯基乙醇 和巯基乙醇 变性：采用尿素和β-巯基乙醇处理，破坏次级键和二硫键，其二、三级结构破坏，肽键不受影响，一级结构仍在，酶活性丧失。 复性：采用透析法除去变性剂和还原剂以后，酶活力几乎恢复到变性前的水平。经检查，其理化性质也与天然酶一致，表明其构象也已恢复。据数学计算，此酶还原后的8个半胱氨酸的巯基重新结合成4对二硫键共有105种可能的配对方式，其中只有一种是正确的配对，而只有按这种正确的配对方式连接才能表现此酶的活性。上述实验酶活性的恢复说明一级结构包含着建立正确的空间结构的全部信息。 （二）一级结构与功能的关系 一级结构是空间构象和功能的基础。一级结构相似的蛋白质，其空间构象和功能也相似。蛋白质一级结构发生改变则影响其正常功能，引起的疾病称为分子病。 许多遗传性疾病是由于某一重要蛋白质的一级结构发生了差错而引起。例如镰刀形红细胞性贫血患者的血红蛋白（HbS，α2β26谷→缬），β亚基第6位谷氨酸变成缬氨酸，使水溶性的血红蛋白具集成丝，相互粘着，导致红细胞变成镰刀状而极易破碎。通过脾脏不易变形而溶血。纯合子HbS占80 %，儿童期就死亡；杂合子HbS 占50 %，只有30岁左右的寿命。这种疾病见于非洲某些地区。 比较一些广泛存在于生物界的蛋白质的一级结构，可以帮助了解物种进化间的关系。物种进化相差越远，一级结构的差别越大。－－分子分类学。 二、蛋白质空间结构与功能的关系 （一）肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）结构 都是含有血红素辅基的蛋白质。 补充内容和时间分配 （10分钟） 上节课内容回顾。 （30分钟）讲授新课，蛋白质的理化性质。把涉及无机化学中的理论回顾讲解一下，更有助于理解和掌握。 （5分钟）以提问的形式和学生互动，总结所学内容。 - 5 -

1.Mb 是一个只有三级结构的单链蛋白质，球状分子内部有一个袋形空穴，血红素居于其中。 2.Hb 是具有四个亚基组成四级结构，成人红细胞Hb主要由两条α链和两条β链组成，α链含141个氨基酸残基；β链含146个氨基酸残基。Hb各亚基的三级结构与Mb相似。 1.协同效应 一个亚基与其配体（Hb中的配体为O2）结合后，能影响此寡聚体中另一亚基与配体的结合能力。如果是促进作用则为正协同效应，反之，则为负协同效应。（寡聚体：由二个或多个亚基组成的蛋白质。无四级结构的蛋白质如溶菌酶、肌红蛋白等称为单体蛋白质。） 2.变构效应 一个氧分子与Hb亚基结合后引起亚基的构象变化，称为变构效应。小分子氧称为变构剂或效应剂。Hb则被称为变构蛋白。变构效应不仅发生在Hb与O2之间，一些酶与变构效应剂的结合，配体与受体的结合也存在着变构效应。一个蛋白质与其它配体（或其它蛋白质）结合后，蛋白质的构象发生变化，使它更适合于功能需要，这一类变化称为变构效应。 蛋白质的理化性质及其分离纯化 一、蛋白质的理化性质 （一）蛋白质的两性电离和等电点 蛋白质分子带有许多可解离基团，在一定的溶液pH条件下可解离为带负电荷或带正电荷的基团，称为两性电离。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负电荷的趋势相等，成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 体内蛋白质的pI大多数为5.0左右，在体液内解离成阴离子。 （二）蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量在1万～100万之间。其分子的颗粒大小可达1～100nm胶粒范围之内。蛋白质胶体稳定的因素有：水化膜和胶粒表面电荷。除去稳定因素，蛋白质极易从溶液中沉淀析出。 （三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 1.蛋白质变性：在理化因素（加热、乙醇、有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子、生物碱试剂等）作用下，蛋白质空间构象破坏，导致其理化性质改变和生物活性的丧失，称为蛋白质变性。不涉及一级结构的改变。变性蛋白质溶解度降低，粘性增加，结晶能力消失，易被蛋白酶水解。蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。变性后，如空间构象严重被破坏，不能复性，称为不可逆性变性。 2.沉淀和凝固：变性蛋白质疏水侧链暴露，肽链融汇相互缠绕继而聚集，易于从溶液中析出，称为蛋白质沉淀。在pH为等电点的溶液中，变性蛋白质可结 （25分钟）蛋白质的分离和纯化，这段内容较难，主要是让学生了解一些生物化学上的实验方法和研究进展。 （25分钟）蛋白质的分离纯化技术的讲解，主要让学生了解分- 6 -

成絮状物，絮状物能溶于强酸或强碱中。经加热，絮状物变成比较坚固不再溶解的凝块，称为凝固作用。 变性的蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性，凝固的蛋白质一定变性。 （四）蛋白质的紫外吸收 由于蛋白质分子中含有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸（Tyr：275nm；Phe：257nm；Trp：280nm），因此在280nm波长处有特征吸收峰。可用于蛋白质定量测定。 （五）蛋白质的呈色反应 1.茚三酮反应：蛋白质水解产生的氨基酸可发生茚三酮反应。 2.双缩脲反应：蛋白质和多肽分子中的肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色和红色，称为双缩脲反应。氨基酸无此反应，此反应可检测蛋白质水解程度。 二、蛋白质的分离和纯化 （一）丙酮沉淀及盐析 使用丙酮（甲醇、乙醇等脱水剂，破坏蛋白质的水化层而使蛋白质沉淀）沉淀时，必须在0～4℃ 低温下进行，丙酮用量10倍于蛋白质在溶液体积。沉淀后立即分离，否则蛋白质会变性。pI时效果更好。 盐析是将高浓度中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等）加入蛋白质溶液，破坏蛋白质在水溶液中的稳定因素（水化层、表面电荷），使蛋白质溶解度降低而从溶液中沉淀析出的现象。各种蛋白质盐析所需的盐浓度及pH均不同。用盐析法可将蛋白质初步分离。盐析一般不会引起蛋白质变性，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，调节盐浓度，可将不同的蛋白质从溶液中先后析出。例如血清加入硫酸铵至50 % 饱和度，球蛋白先析出，再加至饱和，则清蛋白析出。（分段盐析） （二）电泳 带电大分子在电场中向所带电荷相反的电极移动的现象称为电泳。 蛋白质在偏离其pI的溶液中是带电的，在电场中能向相反一极移动。泳动速率与蛋白质所带电荷多少及分子量大小有关。 根据支撑物不同，有薄膜电泳（醋酸纤维薄膜）、凝胶电泳（琼脂糖、淀粉、聚丙烯酰胺凝胶为支撑物）等。 人血清中各种蛋白质的pI不同（中性偏酸）， 将血清点在醋酸纤维薄膜上，在pH 8.6的缓冲液中各种蛋白质带负电荷，电泳时向阳极移动，由于各种蛋白质带电多少、分子量大小不同，泳动速率不同而被分离。电泳后显色，可见各种蛋白质显色区带，用于某些疾病的诊断。 （三）透析 利用透析袋将大分子与小分子分开的方法。透析袋是用具有超小微孔的膜（纤维素膜）制成。微孔只允许分子量为1000以下的化合物通过。 将蛋白质（高分子化合物）溶液放入透析袋，再置于水中，通过不断换水，可把袋内小分子物质（硫酸铵、氯化钠等）全部去尽。袋外放吸水剂（聚乙二醇），还可将蛋白质溶液浓缩。 离纯化的原理和实验手段。 - 7 -

（四）层析 是蛋白质分离纯化的重要手段之一。种类很多，有离子交换层析（根据蛋白质带电荷特性）、亲和层析（利用抗原抗体反应）等。 离子交换层析是利用阴离子交换树脂（带正电荷）可吸附带负电荷的蛋白质，然后用含阴离子（如Cl－）的溶液洗柱，含负电量小的蛋白质先被洗脱，增加Cl－浓度，含负电量多的蛋白质也被洗脱下来，于是蛋白质被分离。 （五）分子筛 又称凝胶过滤，是层析的一种。 层析柱内填满带有小孔的颗粒（葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶），蛋白质溶液从顶部下渗时，小分子蛋白质进入孔内而滞留时间较长，大分子蛋白质迳直流出。不同大小的蛋白质得以分离。 根据待分离蛋白质的分子量大小，应选用不同规格的凝胶层析剂。 （六）超速离心 用于分离纯化蛋白质和测定蛋白质的分子量。 利用50万倍地心引力（5×105g）的超离心力，分离具有不同沉降系数（S）的蛋白质的方法。当浮力与沉降力相等时，沉降停止，不同蛋白质得以分离。此法也可用于核酸和细胞器的分离。 本章小结： 和学生一起回忆第二章讲过的内容，并板书。 思考题、作业题、讨论题： 1.简述蛋白质一级结构与功能的关系。 2.简述二级结构与功能的关系。 3.蛋白质的理化性质。 4.蛋白质的变形与复性。 课后总结分析：

授课题目（章、节或主题）： 第二章 蛋白质化学3 授课类型（请打√） 授课方法（请打√） 授课资源（请打√） 课时安排 授课时间 （20分钟）对第二章内容进行总结，并强调重点、难点。 2 第3周 理论课□√ 研讨课□ 习题课□ 复习课□ 其他□ 讲授□√ 讨论□ 示教□ 自学辅导□ 其他□ 多媒体□√ 模型□ 实物□ 挂图□ 其他□ - 8 -

教学目的： 1.掌握蛋白质一级结构和功能的关系； 2.掌握蛋白质的空间结构与功能的关系； 3.掌握蛋白质的理化性质； 4.了解蛋白质分离纯化技术。 教学方法、手段： 多媒体和板书 教学重点、难点： 1..蛋白质的空间结构与功能的关系； 2..蛋白质的理化性质； 教学内容及过程设计 一、课程回顾 上节课我们学习的内容： 3、 蛋白质的一级结构、二级结构、三级结构、四级结构。 4、 蛋白质结构与功能之间的关系。 二、新课讲授 蛋白质结构与功能的关系 一、蛋白质一级结构与功能的关系 （一）一级结构是空间构象的基础 核糖核酸酶的变性和复性实验是一个很有说服力的证明。 8M尿素 透析去尿素 天然RNA酶 →→→→→→ 变性RNA酶 →→→→→→ 复性RNA酶 β-巯基乙醇 和巯基乙醇 变性：采用尿素和β-巯基乙醇处理，破坏次级键和二硫键，其二、三级结构破坏，肽键不受影响，一级结构仍在，酶活性丧失。 复性：采用透析法除去变性剂和还原剂以后，酶活力几乎恢复到变性前的水平。经检查，其理化性质也与天然酶一致，表明其构象也已恢复。据数学计算，此酶还原后的8个半胱氨酸的巯基重新结合成4对二硫键共有105种可能的配对方式，其中只有一种是正确的配对，而只有按这种正确的配对方式连接才能表现此酶的活性。上述实验酶活性的恢复说明一级结构包含着建立正确的空间结构的全部信息。 （二）一级结构与功能的关系 一级结构是空间构象和功能的基础。一级结构相似的蛋白质，其空间构象和功能也相似。蛋白质一级结构发生改变则影响其正常功能，引起的疾病称为分子病。 许多遗传性疾病是由于某一重要蛋白质的一级结构发生了差错而引起。例如镰刀形红细胞性贫血患者的血红蛋白（HbS，α2β26谷→缬），β亚基第6位谷氨酸变成缬氨酸，使水溶性的血红蛋白具集成丝，相互粘着，导致红细胞变成镰补充内容和时间分配 （10分钟） 上节课内容回顾。 （30分钟）讲授新课，蛋白质的理化性质。把涉及无机化学中的理论回顾讲解一下，更有助于理解和掌握。 （5分钟）以提问的形- 9 -

刀状而极易破碎。通过脾脏不易变形而溶血。纯合子HbS占80 %，儿童期就死亡；杂合子HbS 占50 %，只有30岁左右的寿命。这种疾病见于非洲某些地区。 比较一些广泛存在于生物界的蛋白质的一级结构，可以帮助了解物种进化间的关系。物种进化相差越远，一级结构的差别越大。－－分子分类学。 二、蛋白质空间结构与功能的关系 （一）肌红蛋白（Mb）和血红蛋白（Hb）结构 都是含有血红素辅基的蛋白质。 1.Mb 是一个只有三级结构的单链蛋白质，球状分子内部有一个袋形空穴，血红素居于其中。 2.Hb 是具有四个亚基组成四级结构，成人红细胞Hb主要由两条α链和两条β链组成，α链含141个氨基酸残基；β链含146个氨基酸残基。Hb各亚基的三级结构与Mb相似。 1.协同效应 一个亚基与其配体（Hb中的配体为O2）结合后，能影响此寡聚体中另一亚基与配体的结合能力。如果是促进作用则为正协同效应，反之，则为负协同效应。（寡聚体：由二个或多个亚基组成的蛋白质。无四级结构的蛋白质如溶菌酶、肌红蛋白等称为单体蛋白质。） 2.变构效应 一个氧分子与Hb亚基结合后引起亚基的构象变化，称为变构效应。小分子氧称为变构剂或效应剂。Hb则被称为变构蛋白。变构效应不仅发生在Hb与O2之间，一些酶与变构效应剂的结合，配体与受体的结合也存在着变构效应。一个蛋白质与其它配体（或其它蛋白质）结合后，蛋白质的构象发生变化，使它更适合于功能需要，这一类变化称为变构效应。 蛋白质的理化性质及其分离纯化 一、蛋白质的理化性质 （一）蛋白质的两性电离和等电点 蛋白质分子带有许多可解离基团，在一定的溶液pH条件下可解离为带负电荷或带正电荷的基团，称为两性电离。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负电荷的趋势相等，成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 体内蛋白质的pI大多数为5.0左右，在体液内解离成阴离子。 （二）蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量在1万～100万之间。其分子的颗粒大小可达1～100nm胶粒范围之内。蛋白质胶体稳定的因素有：水化膜和胶粒表面电荷。除去稳定因素，蛋白质极易从溶液中沉淀析出。 （三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 1.蛋白质变性：在理化因素（加热、乙醇、有机溶剂、强酸、强碱、重金属式和学生互动，总结所学内容。 （25分钟）蛋白质的分离和纯化，这段内容较难，主要是让学生了解一些生物化学上的实验方法和研究进展。 - 10 -

离子、生物碱试剂等）作用下，蛋白质空间构象破坏，导致其理化性质改变和生物活性的丧失，称为蛋白质变性。不涉及一级结构的改变。变性蛋白质溶解度降低，粘性增加，结晶能力消失，易被蛋白酶水解。蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。变性后，如空间构象严重被破坏，不能复性，称为不可逆性变性。 2.沉淀和凝固：变性蛋白质疏水侧链暴露，肽链融汇相互缠绕继而聚集，易于从溶液中析出，称为蛋白质沉淀。在pH为等电点的溶液中，变性蛋白质可结成絮状物，絮状物能溶于强酸或强碱中。经加热，絮状物变成比较坚固不再溶解的凝块，称为凝固作用。 变性的蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性，凝固的蛋白质一定变性。 （四）蛋白质的紫外吸收 由于蛋白质分子中含有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸（Tyr：275nm；Phe：257nm；Trp：280nm），因此在280nm波长处有特征吸收峰。可用于蛋白质定量测定。 （五）蛋白质的呈色反应 1.茚三酮反应：蛋白质水解产生的氨基酸可发生茚三酮反应。 2.双缩脲反应：蛋白质和多肽分子中的肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色和红色，称为双缩脲反应。氨基酸无此反应，此反应可检测蛋白质水解程度。 二、蛋白质的分离和纯化 （一）丙酮沉淀及盐析 使用丙酮（甲醇、乙醇等脱水剂，破坏蛋白质的水化层而使蛋白质沉淀）沉淀时，必须在0～4℃ 低温下进行，丙酮用量10倍于蛋白质在溶液体积。沉淀后立即分离，否则蛋白质会变性。pI时效果更好。 盐析是将高浓度中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等）加入蛋白质溶液，破坏蛋白质在水溶液中的稳定因素（水化层、表面电荷），使蛋白质溶解度降低而从溶液中沉淀析出的现象。各种蛋白质盐析所需的盐浓度及pH均不同。用盐析法可将蛋白质初步分离。盐析一般不会引起蛋白质变性，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，调节盐浓度，可将不同的蛋白质从溶液中先后析出。例如血清加入硫酸铵至50 % 饱和度，球蛋白先析出，再加至饱和，则清蛋白析出。（分段盐析） （二）电泳 带电大分子在电场中向所带电荷相反的电极移动的现象称为电泳。 蛋白质在偏离其pI的溶液中是带电的，在电场中能向相反一极移动。泳动速率与蛋白质所带电荷多少及分子量大小有关。 根据支撑物不同，有薄膜电泳（醋酸纤维薄膜）、凝胶电泳（琼脂糖、淀粉、聚丙烯酰胺凝胶为支撑物）等。 人血清中各种蛋白质的pI不同（中性偏酸）， 将血清点在醋酸纤维薄膜上，在pH 8.6的缓冲液中各种蛋白质带负电荷，电泳时向阳极移动，由于各种蛋白质带电多少、分子量大小不同，泳动速率不同而被分离。电泳后显色，可见各种蛋白 （25分钟）蛋白质的分离纯化技术的讲解，主要让学生了解分离纯化的原理和实验手段。 - 11 -

质显色区带，用于某些疾病的诊断。 （三）透析 利用透析袋将大分子与小分子分开的方法。透析袋是用具有超小微孔的膜（纤维素膜）制成。微孔只允许分子量为1000以下的化合物通过。 将蛋白质（高分子化合物）溶液放入透析袋，再置于水中，通过不断换水，可把袋内小分子物质（硫酸铵、氯化钠等）全部去尽。袋外放吸水剂（聚乙二醇），还可将蛋白质溶液浓缩。 （四）层析 是蛋白质分离纯化的重要手段之一。种类很多，有离子交换层析（根据蛋白质带电荷特性）、亲和层析（利用抗原抗体反应）等。 离子交换层析是利用阴离子交换树脂（带正电荷）可吸附带负电荷的蛋白质，然后用含阴离子（如Cl－）的溶液洗柱，含负电量小的蛋白质先被洗脱，增加Cl－浓度，含负电量多的蛋白质也被洗脱下来，于是蛋白质被分离。 （五）分子筛 又称凝胶过滤，是层析的一种。 层析柱内填满带有小孔的颗粒（葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶），蛋白质溶液从顶部下渗时，小分子蛋白质进入孔内而滞留时间较长，大分子蛋白质迳直流出。不同大小的蛋白质得以分离。 根据待分离蛋白质的分子量大小，应选用不同规格的凝胶层析剂。 （六）超速离心 用于分离纯化蛋白质和测定蛋白质的分子量。 利用50万倍地心引力（5×105g）的超离心力，分离具有不同沉降系数（S）的蛋白质的方法。当浮力与沉降力相等时，沉降停止，不同蛋白质得以分离。此法也可用于核酸和细胞器的分离。 本章小结： 和学生一起回忆第二章讲过的内容，并板书。 思考题、作业题、讨论题： 5.简述蛋白质一级结构与功能的关系。 6.简述二级结构与功能的关系。 7.蛋白质的理化性质。 8.蛋白质的变形与复性。 课后总结分析：

（20分钟）对第二章内容进行总结，并强调重点、难点。 - 12 -