产乳酸乙酯酿酒酵母菌株的构建

2018 Vol.37 No.7Serial No.317

China Brewing

Research Report

产乳酸乙酯酿酒酵母菌株的构建

刘港1，李洁S任津莹S郭庆焕S赵东2,陈叶福 '郭学武S肖冬光1

(1.天津科技大学生物工程学院天津市工业微生物重点实验室，天津300457;

2.中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室，四川宜宾4000)

摘要：乳酸乙酯是白酒中重要的呈香物质，并影响着白酒质量和风格。为提高产乳酸乙酯的能力，以植物乳杆菌CLactobac也us

ph^tarurn)为出发菌株，利用同源重组技术，获得高产^乳酸的重组菌株。并分别模拟液态白酒发酵和外源添加乳酸进行发酵，研究 产乳酸乙酯菌株P与出发菌AY12-a株外源添加乳酸发酵产乳酸乙酯的差异。结果表明，用植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因WhL1替换 酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因PDC1，得到重组菌株P。模拟液态白酒发酵过程中，重组菌株P的乳酸和乳酸乙酯产量分别达12. g/L和

162.75 mg/L;出发菌株AY12-a中外源添加相同浓度乳酸进行发酵，乳酸乙酯的产量为115.47 mg/L，仅为重组菌株P的71%。产乳酸乙 酯酵母菌株的构建，初步为豉香型等特定香型白酒的清洁化和机械化酿造奠定了基础。关键词:乳酸乙酯;酿酒酵母;植物乳杆菌;乳酸;乳酸脱氢酶；白酒中图分类号:TS261.1

文章编号:0254-5071 (2018)07-0072-06

doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2018.07.015

Construction of ethyl lactate-producing Saccharomyces cerevisiae

LIU Gang1, LI Jie1, REN Jinying1, GUO Qinghuan1, ZHAO Dong2, CHEN Yefu1 , GUO Xuewu1*, XIAO Dongguang1

(1.Key Laboratory of Industrial Microbiology of Tianjin，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，

Tianjin 300457, China; 2.Key Lab of Solid-state Fermentation ofLuzhou-flavor Baijiu，Yibin 4000, China)

Abstract： Ethyl lactate is an important aroma substance in Baijiu (Chinese liquor), which affects the quality and style of Baijiu. Using Lactobacillus

plantarum as original strain, recombined strain with high yield L-lactate was obtained through homologous recombination technology to improve the

producing ability of ethyl lactate. The fermentation of liquid-state Baijiu and the addition of lactic acid fermentation were simulated separately to study the difference of ethyl lactate producing ability between the lactic acid-producing strain P and the original strain AY 12-a with lactic acid addi­tion. The results showed that recombined strain P was obtained through replacing pyruvate decarboxylase gene PDC1 of Saccharomyces cerevisiae with the lactate dehydrogenase gene ldhL1 of L. plantarum. During the fermentation of simulated liquid-state Baijiu, the yields of L-lactate and ethyl lactate of recombined strain P reached 12. gL and 162.75 mgL, respectively. The ethyl lactate yield of original strain AY12-a was 115.47 mgL with externally adding lactic acid with the same concentration, which was only 71% of the recombinant strain P. The construction of yeast strain with ethyl lactate production laid the foundation for the clean and mechanization brewing of specific flagrant Baijiu such as soybean-flavor Baijiu.Key words： ethyl lactate; Saccharomyces cei^evisiae; Lactobacillus plantarum; lactic acid; lactate dehydrogenase; Baijiu

白酒的主要成分是酒精和水，约1%〜2%为对白酒风 味起主导作用的微量成分，其中酯类物质又占这些微量成 分的60%〜90%[1]。适宜的乳酸乙酯含量对中国白酒的风 味和质量至关重要。清香型白酒酯类化合物中乳酸乙酯仅 次于乙酸乙酯，而对于老白干香型白酒和米香型白酒来说， 乳酸乙酯含量高于乙酸乙酯，其在老白干香型的比例为 1.5〜2.2:1，米香型白酒的乳酸乙酯含量> 0.3 g/L[24]。传统白 酒发酵过程中，通常以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 作为发酵主体，结合环境和自然制曲提供的产酯前体乳酸 菌等微生物产生乳酸等有机酸，并与乙醇发生酯化反应生 成酯类物质来提高白酒品质[5]。随着白酒工业的现代化发

收稿日期：2018-04-26

修回日期：2018-07-08

展，酿造技术的机械化越来越受到人们的关注，清洁生产 和良好生产规范(good manufacturing practices，GMP)理念逐步在白酒行业应用，白酒行业将迎来重大的变革[6]。白酒 生产机械化对一些传统工艺提出了新的挑战，同时意味着 发酵过程中乳酸菌等微生物的带入几率下降，乳酸乙酯的 生成量下降，严重影响白酒风味。因此，白酒机械化必须与 发酵微生物的研发同步[7]。构建具有一定产乳酸进而生成 乳酸乙酯能力的酿酒酵母菌株，不仅可以使发酵易于控制， 而且可以增加乳酸乙酯的产量，弥补白酒的风味的不足， 在特征饮料酒的酿造中大有用武之地。酵母改造产乳酸多 应用于工业上聚乳酸生产，2003年COLOMBO S等[8]将植

基金项目：国家自然科学基金项目（31671843)资助；中国轻工业浓香型白酒固态发酵重点实验室开放基金项目（2017JJ003) 作者简介:刘港(1992-),男，硕士研究生,研究方向为现代酿造技术。

*通讯作者:陈叶福（1973-),男，教授，博士,研究方向为现代酿造技术。

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总第317期

’73’

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物乳酸杆菌CLactobaciWuspianetarium)的乳酸脱氢酶基因

WiL]整合到酿酒酵母基因组中，对发酵条件进行优化后重 组菌株的L-乳酸产量达50 g/L，为聚乳酸的生产提供大量的 L■乳酸前体。2009年TOKUHIRO K等[9]在酿酒酵母中増加

乳酸脱氢酶基因LDH的拷贝数至四拷贝，突变株的L■乳酸 产量达74.1 g/L，乳酸对葡萄糖的产率明显提高，达0.69 g/g。 国内尚未见酿酒酵母过表达乳酸脱氢酶生产L-乳酸进而 产乳酸乙酯应用于白酒工业的研究报道。

本研究利用同源重组[1W1]技术，用植物乳杆菌的乳酸 脱氢酶基因WiL1替换酿酒酵母丙酮酸脱竣酶基因PDC1 获得产L■乳酸进而生成乳酸乙酯的能力的重组菌株。并分 别模拟液态白酒发酵和外源添加乳酸进行发酵，研究产乳 酸菌株与出发株外源添加乳酸发酵产乳酸乙酯的差异。1材料与方法 1.1材料与试剂 1.1.1菌株和质粒

实验所用的菌株和质粒见表1。其中植物乳杆菌 (Lactobaciiiuspiantarum)用以乳酸脱氢酶基因WiL1的扩 増模板，pUG6质粒为筛选标记ioxp-KanMX-ioxp的扩増模 板，pGAPza质粒用以筛选标记KanMX的丢除。

表1

菌株和质粒基因型以及来源

Table 1 Genotype and sources of strains and plasmids

菌株和质粒

基因型来源

菌株

大肠杆菌(Escherichia

supE44AlacU169980lacZAM15)

coli) DH5ahsdR17 recAl endAl gyrA96 thi-1 relA

本实验室L. plantarumWild type strain

本实验室AY12工业白酒酵母营养双倍体

安琪酵母AY12-a

AY12的单倍体，a型

本实验室质粒

Yep352Ap1■，表达载体

本实验室Yep352-PKApr，Kanr，PGK1T-loxP-KanMX-loxP

表达盒

本实验室pUG6Apr，loxP-KanMX-loxP表达盒

本实验室pGAPza

Apr，Cre-loxp操作体系

本实验室

1.1.2培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，

YEPD)培养基：葡萄糖20.0 g/L，酵母粉10.0 g/L，蛋白胨

20.0 g/L。

乳酸细菌培养基(MRS):蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10 g/L， 酵母膏5.0 g/L，柠檬酸氢二铵2.0 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温801.0 mL/L，乙酸钠 5.0 g/L，磷酸氢二钾 2.0 g/L，硫酸镁 0.58 g/L， 硫酸锰0.25 g/L，调节pH至6.2〜6.6。

LB (Luria-Bertani)培养基:葡萄糖 10 g/L，酵母粉 5 g/L，

蛋白胨10 g/L。

上述培养基配制固体培养基时加2%琼脂，121 °C灭菌

15 min。

半乳糖诱导液态培养基：半乳糖20.0 g/L，蛋白胨 20.0 g/L，酵母浸粉 10.0 g/L，121 C 灭菌 15 min。

一级种子培养基和二级种子培养基分别由糖度为8 °Bx 和12 °Bx的玉米水解液加5 mg/L的酵母浸粉构成;发酵培 养基为糖度为18 °Bx的玉米水解液加适量营养盐组成。种 子培养基及发酵培养基105 C灭菌15 min备用。1.1.3试剂

PrimeSTAR Max高保真脱氧核糖核酸(deoxyribonu­

cleic acid， DNA)聚合酶 (2x)、rTaq 聚合酶 (5 U/pLKDNA

连接酶 SolutionI (350 UVL)、性内切酶 Xbal (5 UVL) 和BamHI(5 U/^L):大连宝生物工程有限公司；卡那霉素

(kanamycin，Kan):美国Amreco公司；遗传霉素(G418):

美国Merck公司；耐高温糖化酶(2x104 U/mL)、液化酶（1x 105 U/mL)、酸性蛋白酶（lxl05 U/mL):丹麦Novozymes公 司。质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、切胶回收试剂 盒:北京Solarbio科技有限公司。1.2仪器与设备

PCT-200聚合酶链式反应(polymerase chain reaction， PCR)基因扩増仪、DYY-4c型电泳仪:美国BIO-RAD公司； AgilentGC70气相色谱仪(gas chromatography，GC)、Ag­ilent 1100 型高效液相色谱仪 (high performance liquid chro- matography，HPLC):美捷伦科技有限公司。

1.3方法

1.3.1产乳酸乙酯菌株的构建

纯种酿酒酵母自身没有乳酸代谢的能力，不能进一步 产乳酸乙酯。因此，本研究利用酿酒酵母PGK终止子和筛 选标记KanMX，并用植物乳杆菌的乳酸脱氢酶基因ldhL1 替换酵母的丙酮酸脱氢酶基因PDC1，以获得一株产乳酸 进而具有产乳酸乙酯能力的菌株。

(1)引物设计

根据GenBank报导的PDC1、ldhL1基因的核苷酸序列，本实验所用到的PCR反应弓丨物见表2。用Primer 5.0对引 物进行设计，所有引物均由苏州金唯智有限公司合成，酶 切位点加下划线表示。

表2 PCR引物及序列

Table 2 PCR primers and their sequences

引物名称

序列(5、3，）

酶切位点

PGK1t-UCGCGGATCCCGATAGATCAATTTTTTTCBamHI

PGK1GCGTACGAAGCTTCAGCTGTAACGAACG

t-DCAGAATTTTCKr-UGAAAATTCTGCGTTCGTTACAGCTGAAG

CTTCGTACGCTGCKr-DCTAGTCTAGAGCATAGGCCACTAGTGGAT

XbaIPA-UCGGGATCCCTTCCGCTTTGCCATTBamHI

PA-D

ACACAACTTTTTGATGATTTGGCATTTTGA

TTGATTTGACTGTGTTATTT

•74.

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续表

引物名称序列(5'—3〇

酶切位点

PB-UTATCAGATCCACTAGTGGCCTATGCACTTT

CCCAAACAACACCT

PB-DGGAATTCCGTTGGTAGCAGCAGTCEcoRI

ldhL1-UAAATAACACAGTCAAATCAATCAAAATG3

CCAAATCATCAAAAAGTTGldhL1-DGAAAAAAATTGATCTATCGTTATTTATT3

TTCTAATTCAGCPK-UGCTGAATTAGAAAATAAATAACGATAGA3

TCAATTTTTTTCPK-DTACCGTAGGTGTTGTTTGGGAAAGTGCAT3

AGGCCACTAGTGGAT

P1-UTGGCATCTTCACCGP2-D

TGTGCTACTACAACTGTTCAT

注:“U”表示上游引物，“D”表示下游引物。

(2)DNA提取及纯化

基因组DNA提取及DNA纯化回收参见文献[12];质粒 提取方法参见文献[13]。

()重组质粒Yep352-PK的构建

以出发菌株AY12-a的基因组和质粒pUG6作为模板， 分别扩增得到终止子PGK17和筛选标记KanMX片段，将纯化 的PGKi^DKanMX片段融合，得到融合片段PGKVKanMX。 将纯化的PGK1rKa^MX片段和Yep352质粒分别用XbaI和

BamHI酶切，回收后进行连接得到重组质粒Yep352-PK。构

建的质粒Yep352-PK用以带乳酸脱氢酶基因IdhLi和下同 源臂侧翼序列的PGK1rKanMX片段的大量扩增，构建过程 见图1。

2/d Origin

图1重组质粒Yep352-PK的构建

Fig. 1 Construction of recombinant plasmid Yep352-PK

(4)醋酸锂化学转化[14]与重组菌株的鉴定

以酿酒酵母AY12-a的基因组作为模板，PCR扩增得到

启动子兼上同源臂的PA及下同源臂PB片段；以植物乳杆 菌的基因组作为模板，PCR扩增得到乳酸脱氢酶基因WhL1 片段；以质粒Yep352-PK作为模板，PCR扩增得到PGK1r

KanMX片段。将纯化的片段:PA、idhL1、PGK1rKa^MX和 PB利用醋酸锂化学转化法导入酵母细胞AY12-a中。转化

后的细胞涂布于终浓度为300 pg/mLG418的YEPD培养 基上进行筛选，挑取转化子，提取基因组进行PCR验证。

(5)转化子筛选标记的去除

用醋酸锂化学转化法将PGAPza质粒导入突变株中， 通过Cre-Lxop系统将整合到基因组上的抗性基因Ka^MX去除。

1.3.2生长曲线绘制

分别从斜面上挑取1环菌株AY12-a和P接种于5 mL

YEPD液体培养基中，30 °C、180 r/min培养12 h。每隔1 h取

相应量的活化菌体接入对应体积的新鲜YEPD液体培养 基中，以不加菌液的空白培养基作为对照，在生长曲线测 定仪中测定其波长600 nm处的吸光度值。以培养时间为横 坐标，吸光度值为纵坐标，绘制菌株AY12-a和P生长曲线。 1.3.3乳酸耐受性实验

从斜面刮取一环AY12-a菌株接种于5 mL的YEPD液 体培养基中，30 C、180 r/min过夜培养，高速离心收集菌体， 并用无菌水洗两次。测定菌液的浓度并调节菌液的〇D_nm 值为1.0,同时对菌液进行10倍梯度稀释，依次取2 ^L分 别点滴于添加有 1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、6.0% 乳酸的YEPD平板上，30 C静置培养2〜3 d，观察菌落形态。 1.3.4发酵性能测定

(1)

玉米液态白酒发酵:分别从4 C保藏的固体斜面

挑取1环出发菌株AY12-a和重组菌株P接入装有5 mL— 级种子玉米水解液培养基中，30 C静置培养至稳定期(约 24 h)。将一级培养物全部转入装有45 mL二级种子玉米水 解液培养基中，30 C静置培养16 h，测定菌液的OD600nm值， 取相应的体积换算成相同的菌体数量接种到配制好的 135 mL发酵培养基中。30 C培养箱静置发酵，每隔12 h称 质量一次，发酵结束后分别测定C〇2总质量损失、乙醇、乳 酸、还原糖及酯类含量。

(2)

外源添加乳酸发酵实验：一、二级种子的培养与

(1)中一致，依据出发菌株AY12-a对乳酸的耐受性，确定 乳酸的添加浓度，在发酵培养基中添加相应浓度的乳酸 进行发酵。30 C培养箱静置发酵，每隔12 h称质量一次，发

酵结束后分别测定C〇2总质量损失、酒精度、还原糖及酯 类含量。1.3.5测定方法

(1)C〇2总质量损失、还原糖含量、酒精度测定：按照 参考文献[15]的方法进行。

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*75*

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⑵乳酸含量的测定

采用高效液相色谱法(HPLC)测定发酵液中乳酸的含 量。HPLC的检测条件:HPX-87H色谱柱GOO mmx7.8 mm)， 流动相为5 mmol/L稀硫酸，流动相流速为0.6 mL/min，柱温 65 °C，检测器温度45 °C，采用示差折光检测器检测。用流 动相对样品进行稀释后，用0.22 pm的滤膜进行过滤，采用 外标法对发酵液进行定量。制作标准曲线的标准偏差达 0.999以上方可用于数据的分析。

G)酯类含量的测定

气相色谱法:根据利用气相色谱检测白酒的文献[16]， 气相色谱仪条件：AT丄ZP-930白酒专用色谱柱（50 mx 320 pmx1 pm);火焰离子化检测器（flame ionization de­

tector， FID)，检测器温度 200 C;载气为高纯氮 (凡)，流速 5 mL/min;检测条件:程序升温，50 C保持8 min，5 °C/min 升至120 C，保持8 min;进样口温度200 C;进样量1.0 pL;

分流比为10:1。2结果与分析

2.1产乳酸菌株的构建及鉴定 2.1.1重组质粒Yep352-PK的构建

使用1.3.1的方法，构建表达质粒Yep352-PK。对构建的

Yep352-PK质粒进行PCR验证，其结果如图2所示。

M为5 000 bp DNA Marker; 1〜3分别为从重组质粒Yep352-PK上分别 扩增的 KanMX(1 613 bp)、PGK1T(258 bp)和 PGK1T-KanMX(1 871 bp)

基因段

图2

重组质粒Yep352-PK的PCR扩增结

Fig. 2 Results of PCR amplification of recombiant plasmid Yep352

由图2可知，以Yep352-PK为模板，扩增得到1 871 bp 的 PGK]rKanMX片段、258 bp 的 PGK1t 片段和 1 613 bp 的

KanMX片段。PCR验证结果与理论预期相符，说明PGK1r KanMX基因片段成功插入Yep352的多克隆位点处， Yep352-PK质粒构建成功。

2.1.2过表达重组菌株的构建

将转化片段PA、

、PGK]T-KanMX和PB用醋酸锂

化学转化法导入酵母细胞AY12-a中。通过PA和PB片段与 酵母基因组上PDC1基因两侧的同源序列发生同源重组， 从而实现了

基因的过表达盒整合到酿酒酵母染色体

上，同源重组过程如图3所示。

Fig. 3 Homologous recombination process of converted fragments

在上同源臂PA上游设计引物P1-U，结合ldM1-D以验 证上游片段的整合;设计引物ldMJ-U/Kr-D以验证中游片 段的整合;在下同源臂PB下游设计引物P2-D，结合Kr-U以 验证下游片段的整合。PCR扩增结果用0.8%琼脂糖凝胶电 泳结果见图4。

(a) M为DL5 000 DNA Marker，1为以出发菌株基因组作为模板，

P1-U/P1-D为引物的PCR扩增结果;2为以转化株基因组作为模板，

P1-U/ldhL1 -D为引物的PCR扩增结果；

(b) 中 M为 DL5 000 DNA Marker，1 为以出发菌 ， P2-U/P2-D为引物的PCR扩增结果;2为以转化株基因组作为模板，

ldMJ-U/Kr-D为弓丨物的PCR扩增结果；

(c) 中 M为 DL5 000 DNA Marker，1 为以出发菌 ，P3-U/P3-D为引物的PCR扩增结果;2为以转化株基因组作为模板，

Kr-U/P2-D为引物的PCR扩增结果

图4

不同引物的PCR扩增结果

Fig. 4 Results of PCR amplification using different primers

由图4可知，提取转化子的基因组作为模板进行PCR验 证，上游引物P1-U/ldM1-D的PCR产物可看到一条2 800 bp左右的特异性条带；中游引物ldM1-U/Kr-D的PCR产物经

•76.

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0.8%的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条2 900 bp左右的特异 性条带;下游引物&-U/P2-D的PCR产物经0.8%的琼脂糖凝 胶电泳，可看到一条4 000 bp左右的特异性条带，出发菌株

AY12-a型单倍体的阴性对照无条带，说明重组盒PA-WhL1-

偷K-PB片段已成功重组到酿酒酵母AY12-a基

因组中，并且重组位置也正确。2.0转化子筛选标记的去除

去掉突变株基因组上的抗性基因后，得到遗传 霉素抗性丢失的重组菌株P并进行后续实验。2.2重组菌株P的生长性能测定

出发菌株AY12-a和重组菌株P的生长曲线测定结果 见图5。

图5出发菌株AY12-a和重组菌株P生长性能的比较

Fig. 5 Comparison of growth performance of original strain AY12-a

and recombinant strain P

从图5可以看出，与出发菌株AY12-a相比，重组菌株P 的整体生长趋势与出发菌株基本保持一致(P<0.05)，生物 量最终能够达到与出发菌株AY12-a相同的水平，到达稳 定期时重组菌株P的生物量略低。结合发酵实验确定乳酸 产生，结果表明，重组菌株P代谢产生的乳酸对菌株的生 长基本没有影响。

2.3重组菌株P的基本发酵性能测定

将亲本AY12-a与重组菌株P同时进行玉米水解液发 酵。发酵结束后测定各菌株的基本发酵性能，结果见表3。

表3

出发菌株AY12-CC和重组菌株P的发酵性能比较

Table 3 Comparison of fermentation performance of original strain

AY12-a and recombinant strain P菌株C〇2总质量损失/g还原糖Ag*L-1)乙醇Kg.L-1)乳酸Kg.L-1)

AY12-a12.4±0.120.42±0.1280.27±10.11NF重组菌株P

11.2±0.08

0.52±0.13

73.35±9.23

12.±0.31

注:NF为未检出。下同。

由表3可知，过表达WhLi基因的重组菌株P与出发菌株

AY12-a在相同条件下C〇2总质量损失、还原糖含量等主要 发酵性能没有明显变化(P<0.05)，乙醇产量稍有降低但

不是很明显(P>0.05)，表明过表达WhL1基因对菌株的发 酵性能没有太大影响。

同时，过表达WhLi基因的重组菌株P的L-乳酸产量达 12. g/L，而乙醇的产量有所降低，这是由于乳酸脱氢酶 代谢途径的引入，使得糖酵解产生的丙酮酸在厌氧发酵过 程中部分分流流向了L-乳酸。最大理论值为每克葡萄糖发 酵产生0.51 g乙醇，最大理论值为每克葡萄糖发酵产生1.0 g 乳酸，实验测得发酵培养基的葡萄糖含量为172.30 g/L，亲 本菌株AY12-a和重组菌株P的乙醇对葡萄糖产率分别为 0.47 g/g和0.42 g/g，乙醇产率结果差异不显著(P>0.05)， 同时重组菌株P的L-乳酸对剩余葡萄糖产率为0.41 g/g。实 验结果支持了 COLOMBIE S等[18]在酿酒酵母中整合过表 达植物乳杆菌WhL]基因可以达到积累L-乳酸的结论。2.4产乳酸菌株与外源添加乳酸发酵产乳酸乙酯的差异

为了比较出发菌株AY12-a与重组菌株P对乳酸的利 用能力，在出发菌株AY12-a可以耐受乳酸的浓度范围下对 其进行了添加乳酸的发酵实验。由前述可知重组菌株P的 乳酸产量达12 g/L，为不加乳酸发酵的阴性对照。2.4.1乳酸添加量的确定

用无菌水调节菌液浓度为〇〇__=1.0,10倍梯度稀释， 依次取2 ^L分别点滴于添加1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、 4.0%、6.0%乳酸的YEPD平板。结果如图6所示。

101

10_2

10_3

1〇-4

图6

出发菌株AY12-a的乳酸耐受性

Fig. 6 Lactic acid tolerance of original strain AY12-a

由图6可知，乳酸添加量为1.0%〜3.0%时，菌株AY12-a的菌落形态正常，基本不影响菌体的生长;当乳酸添加量 提高至3.5%时，菌浓较低时菌落形态明显发生变化，因此 菌株AY12-a对乳酸的耐受浓度为3.5%。因此添加与产乳 酸菌株相同水平的乳酸(添加量为1.0%，质量浓度为12 g/L) 基本不会影响菌株的生长。2.4.2添加乳酸发酵性能比较

以不加乳酸的出发菌株AY12-a和重组菌株P作为对 照，对出发株AY12-a添加12 g/L的乳酸进行发酵实验。发酵 结束后测定各菌株的基本发酵性能，结果见表4。

由表4可知，添加12 g/L的乳酸进行发酵，与重组菌株

P的C〇2总质量损失和乙醇产量差异不显著(P>0.05)，说明

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，~n •乳酸的添加没有明显影响酵母菌株的生长。同时，发酵液 中菌株AY12-a的乳酸含量基本保持不变，表明外源添加的 乳酸大部分以游离的形式存在。

表4

lactic acid

菌株 AY12-aAY12-a (乳酸

浓度为12 g/L)

P

C〇2总质量损失/g还原糖化七1)乙醇(g，L-1)乳酸化七1)

12.3±0.1411.8±0.2311.1±0.10

0.46±0.130.63±0.250.48±0.12

80.45±10.21

NF

谢工程等操作技术，进一步协调乳酸与乙醇、乳酸与乳酸 乙酯的比例，为米香型白酒机械化生产技术革新提供了一 种新型酵母菌，有效避免窖泥微生物代谢产生的异味物质 对白酒风味不利的影响。

产乳酸酵母的构建也为进一步提高乳酸乙酯产量奠 定了物质基础，由此可以进一步构建乳酸到乳酸乙酯的酶 催化反应通路，得到高产乳酸乙酯酵母菌株以用于白酒工 业生产。参考文献：

添加乳酸后发酵性能比较

Table 4 Comparison of fermentation performance after adding

72.69±10.0311.56±0.2174.16±9.22

12.76±0.30

[1] 康文怀，徐岩.中国白酒风味分析及其影响机制的研究J].食品科

学技术学报，2012,30 (3): 53-58.

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表5添加乳酸对高级醇和酯含量的影响

Table 5 Effect of adding lactic acid on the contents of higher

alcohols and esters

mg/L

菌株 AY12-a

正丙醇 异丁醇

异戊醇乳酸乙酯苯乙醇

NF

44.52±0.42

22.16±0.14 28.92±0.20 130.19±0.10

浓^为°(乳酸 22.81±0.23 28.18±0.16 98.01±0.21 115.47±0.56 46.86±0.36

P

16.29±0.25 25.±0.25 54.86±0.18 162.75±0.81 21.32±0.46

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由表5可知，产乳酸的重组菌株P其乳酸乙酯产量为 162.75 mg/L，乳酸到乳酸乙酯的转化率为1.04%;菌株 AY12-a不添加乳酸进行发酵检测不到乳酸乙酯的产生； 添加与重组菌株P产量相同的乳酸含量（12 g/L)，出发株 AY12-a的乳酸乙酯产量达115.47 mg/L，仅为产乳酸菌株P 的71°%，结果差异显著(P<0.05)，表明重组菌株P胞内乳 酸较胞外添加乳酸对乳酸乙酯的合成更具优势。结果表明 过表达WhLJ基因使发酵的代谢流由乙醇部分流向了 L^L 酸，胞内产生的L-乳酸作为一种次级代谢产物，在酵母的 胞内发生化学反应生成乳酸乙酯。酿酒酵母本身对乳酸 具有一定的化学作用，但是这种效果较自身产乳酸的重组 菌株P低，这可能是由于外源乳酸进入胞内部分被细胞膜 所阻碍，胞内自身产生的乳酸浓度高且更容易被胞内酶 所催化使重组菌株P的乳酸乙酯含量较高。同时重组菌株 P的总高级醇（正丙醇、异丁醇、异戊醇和苯乙醇）的含量降低至118.11 mg/L，而出发菌AY12-a的总高级醇含量为 225.79 mg/L，降低了约 47.7%。3结论

与添加相同浓度乳酸的出发菌株AY12-a发酵相比， 实验得到产L-乳酸酵母菌株，其乳酸乙酯的产量明显提高 (PC0.05)，达162.75 mg/L。可以进一步结合启动子工程，代

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