高温胁迫影响雄性棉铃虫生殖力的生理机制

高温胁迫影响雄性棉铃虫生殖力的生理机制3

郭慧芳,陈长琨,李国清,陈文武,王荫长

(南京农业大学植物保护学院,南京　210095)

摘要:为明确高温(33℃)影响棉铃虫雄性生殖力的生理机制,在明确棉铃虫对高温敏感期的基础上,用孚尔根涂片法通过光镜定性观察和定量分析了高温对精子发生和形成过程的影响,同时也对高温下精包腺和附腺的结构和功能作了研究。结果表明,棉铃虫雄性6龄幼虫至3日龄蛹期以及成虫期对高温敏感,6龄幼虫和蛹前期对高温的敏感性是由于高温影响了真核和无核精子的形成过程,其中精细胞囊期对高温最敏感,精细胞囊经受高温后,不能充分伸长,导致蛹后期精巢中出现大量畸形精细胞囊,高温还导致畸形精子束的产生;成虫期对高温的敏感性可能与精包腺分泌蛋白量减少有关。

关键词:高温;棉铃虫;雄性;繁殖力

中图分类号:S435.622　　　文献标示码:A文章编号:100227807(2002)0220085205bollworm.Hightemperatureinhibitedeupyrene2apyrenespermiogenesisbutdidnotaffecteupyrene2apyrenespermatogenesis,andthesensitiveperiodtohightemperaturewaseupyrene2apyrenespermatidcyststage.Eupyrenespermiogenesiswasspoiledbyhightemperatureintheperiodfrom6thinstarlarvaeto32day2oldpupaewhichconsistentwiththeperiodoffertileeggproduction,andapyrenespermiogenesisinwholepupaestage.Hightemperatureaffectedtheelongationofspermatidcystandthedevelopmentofspermbundlealso.Hightemperatureacceleratedthedevelopmentofmaleaccessoryglandandspermatophoregland,anddepressedthespermatophoreglandsecretioncapacityinadultstage.Fromabove,wecanconcludethateffectofhightemperatureonfecundityofmalecottonbollwormwasmainlyduetospermiogensisbeforeemergence,andinadultstageitseemsrelatedtospermatophoreglandsecretion,theotherreasonsneedfurtherstudy.

Keywords:hightemperature;malebollworm(Helicoverpaarmigera);reproductivecapacity

PhysiologicalEffectofHighTemperatureonFecundityinMaleCottonBollworm(Helicoverpa

armigera)

GUOHui2fang,CHENChang2kun,LIGuo2qing,CHENGWen2wu,WANGYin2chang(CollegeofPlantProtection,Nanjing

AgriculturalChina)

University,

Nanjing

210095,

Abstract:Inordertoclarifytheeffectmechanismofhightemperatureonmalecottonbollwormfecundity,theeffectofhightemperature(33℃)onspermatogenesisandspermiogenesisbyFeulgenSpreadProcedurewasinvestigated,andthedevelopmentandsecretionofmaleaccessoryglandandspermatophoreglandwerestudied.Theresultsshowedthattherewaseupyrene2apyrenedichotomousspermatogenesisincotton

收稿日期:2001—04—19

基金项目:国家自然科学基金项目(A9904)和江苏省“九

五”攻关项目(BE96370)资助

作者简介:郭慧芳(19732),女,助研;现在江苏省农科院

植保所工作,Email:guohf@ipp.jaas.ac.cn

棉铃虫是棉花上重要害虫,其繁殖潜能大,对环境适应性强,常猖獗发生,造成棉花生产巨大损失。温度是影响棉铃虫种群动态的重要环境因素。吴坤君曾报道[1]35℃以上高温对棉铃虫雌虫产卵不利;作者的研究表明[2],33℃高温胁迫不仅使雌虫产卵力下降,而且完全抑制了雄虫生殖力。在此基础上重点研究高温胁迫影响棉铃虫雄性生殖力的生理生化机制。

昆虫精子发生和形成是雄性生殖的核心。有关高温对昆虫精子发生和形成的影响已在家蚕、果蝇、小地老虎和粘虫中等报道[325],它们的高温效应有一定的差异,对温度敏感的果蝇品系在高温下精母细胞不能进行减数,家蚕在35℃高温下真核精子头部缩短,精子束膨大;而小地老虎、粘虫在32℃以上高温下真核2无核精子形成过程阻断,但不影响其发生过程。昆虫雄性生殖腺包括附腺和精包腺亦具有重要的生殖功能,高温

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对雄性附腺的影响已在家蚕和小地老虎中有研究[6,7]。为揭示高温影响棉铃虫雄性生殖力的生理机制,本文同时对高温对精子发生和形成以及雄性生殖腺的影响作一研究,以期为害虫的治理提供新思路,同时也丰富昆虫精子发生学的研究。

1　材料和方法

1.1　供试昆虫饲养

精细胞囊和精子束进行计数[8]。

1.4　附腺和精包腺长度测量和蛋白质测定

在生理盐水中分别取出雄蛾0、1、2、3日龄附腺和精包腺,直接测量长度。将3日龄雄蛾的附腺和精包腺加生理盐水匀浆,在1500r・min21下离心30min,上清液备用。用752型分光光度计,采用Folin法测定蛋白质量。

供试昆虫为室内(28℃)累代人工饲料饲养。1.2　处理虫期设置及繁殖力观察

以33℃±1℃高温分别处理雄性6龄幼虫期、1～3日龄蛹期以及4日龄蛹期至羽化阶段,将处理雄蛾与正常雌蛾在常温下(28℃)下配对,成虫阶段高温处理则以正常雌雄蛾在高温下配对。统计雌蛾产卵量及受精卵量。

1.3　精子发生和形成的定性观察和定量分析

在生理盐水中取出供试昆虫的精巢,将内含物涂在载玻片上的一固定框内,晾干后用改良的孚尔根涂片法染色,细胞质呈绿色,细胞核呈红色,光学显微镜下观察精子发生和形成过程并对

2　结果与分析

2.1　雄性棉铃虫对高温的敏感期

为研究雄性生殖力受高温影响的生理机制,首先需明确雄性对高温的敏感期。对阶段性高温处理雄性配对雌蛾的产卵量以及受精卵量的观察分析表明(图1),雄性6龄幼虫期至3日龄蛹期以及成虫期对高温敏感,因高温处理雄性6龄幼虫期、蛹期以及成虫期,其配对雌蛾受精卵产量(301、0和0粒,单雌蛾卵量,下同)均极显著低于对照(7粒),但高温处理4日龄至羽化,受精卵量(610粒)与对照无差异。处理阶段

图1　雄性阶段性高温处理对配对雌蛾产卵和卵受精的影响

Fig.1Effectonfertileeggproductionoffemalematedwithmaletreatedwithhightemperatureindifferentstages

(注:图中3表示与对照差异显著,33表示与对照差异极显著(t2测验,n=30),下同;Note:3and33meanstherewassignificantandverysignificantdifferencebetweenthetreatmentandthecontrol.(ttest,n=30),soasfollows.)

2.2　高温对精子发生和形成的影响2.2.1　棉铃虫精子发生和形成过程。用孚尔根涂片观察了棉铃虫精子发生和形成过程发现,棉铃

2.2.2　高温对真核精子发生和形成的影响。对阶

虫的精子发生和形成包括真核和无核精子交叉发

生和形成过程,真核精子发生过程包括精原细胞囊期(E1a)、初级精母细胞囊期(E1b)、次级精母细胞囊期(E1c)、精细胞囊期(E2),真核精子形成阶段包括伸长的精细胞囊期(E3)、发育中的精子束期(E4)和成熟的精子束期(E5)(图󰂪)。在蛹初期,真核精子发生随着向无核精子发生转换而终止。无核精子发生主要在蛹期进行,其发生过程包括精原细胞囊期(A1a)、精母细胞囊期(A1b)、精细胞囊期(A2)、发育中的精子束期(A3)和成熟的精子束期(A4)(图󰂫)。各级生精囊的形态特征见表1。

段性高温处理雄虫蛹后期精巢中的生精囊和精子束进行了详细观察,其显著的形态差异表现为:高温导致精细胞囊不能伸长,细胞核无法向顶部集中;此外导致畸形精子束的产生,精子束或鞭毛异常卷曲,或鞭毛膨大,或核区极短(图󰂬)。定量分析结果表明(图2),(1)高温对真核精子发生无显著影响,6龄幼虫期、1～3日龄蛹期、4日龄蛹至羽化及全蛹期高温处理,每头精子发生总数分别为1404、1375、1399和1352个,与对照(1523个)无明显差异;(2)高温主要影响真核精子的形成,在6龄幼虫期、1～3日龄蛹期和全蛹期高温处理,蛹后期精巢中均出现大量异常的精细胞囊和精子束,在4日龄蛹至羽化高温处理,无异常精细胞囊,但出现较多的异常精子束。高温处理组中正

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常精子束数量以4日龄蛹至羽化组最高,每头为982条,6龄幼虫和1～3日龄蛹处理组分别为每头405和275条,而蛹期高温处理组为0,对照组则高达1481条;(3)精子形成过程中以精细胞囊期对高温最敏感,精细胞囊经受高温后,其伸长受到抑制,无法完成随后的精子形成过程,滞留在精巢中。在6龄幼虫期、1～3日龄蛹和全蛹期高温处理,其蛹后期精巢中异常精细胞囊数量分别为每头317、705和758个,而4日龄蛹以后高温处理组以及对照组,均无异常精细胞囊出现。以上4

)出个处理在蛹后期精巢中都有异常精子束(EA’

现,其数量分别为每头682、275、417和594条。

E1a:精原细胞囊　E1b:初级精母细胞囊　E1c:次级精母细胞囊E2:精细胞囊　E3:伸长的精细胞囊　E4:发育中的精子束E5:成熟的精子束(×150)

E1a:spermatogoniumcyst,E1b:primaryspermatocytecyst,E1c:secondaryspermatocytecyst,E2:spermatidcyst,E3:elongatedspermatidcyst,E4:developingspermbundleE5:maturespermbundle

图󰂪　真核精子的发生和形成过程

Fig.󰂪Spermatogenesisandspermiogenesisofeupyrene

A1a:精原细胞囊　A1b:精母细胞囊A2:精细胞囊　A3:发育中的精子束A4:成熟的精子束(×150)A1a:spermatogoniumcyst,A1b:primaryspermatocytecyst,A2:spermatidcyst,A3:developingspermbundle,A4:maturespermbundle

图󰂫无核精子的发生和形成过程

Fig.󰂫Spermatogenesisandspermiogenesisofeapyrene

EA:异常的真核精细胞囊　EA’1:核区极短的真核精子束EA’2:鞭毛异常卷曲的真核精子束EA’3:鞭毛膨大的真核精子束(×150)

EA:abnormalspermatidcystofeupyrene,EA’1:spermbundlewithshortnucleus,EA’2:spermbundlewithcurledflagellum,EA’3:spermbundlewithexpandedflagellum

图󰂬　异常的真核精细胞囊和异常的真核精子束

Fig.󰂬Abnormalspermatidcystandspermbundleofeupyrene

AA:异常的精细胞囊(×150)AA:abnomalspermatidcyst图󰂭异常的无核精细胞囊

Fig.󰂭Abnormalspermatidcystofapyrene

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表1　棉铃虫各级真核和无核生精囊的形态特征

Table1Morphologicalcharactersofeupyreneandapyrenespermatidsyst形态特征出现阶段长径或短径󰃗Λm

圆形,细胞核发达,细胞质较少圆形,体积变大,细胞质增多

圆形,体积进一步增大,囊中出现空隙。囊体一端伸长

囊体充分伸长,并且细胞核向顶端集中,随后细胞核开始伸长

鞭毛的前端形成膨突并逐渐向尾部移动,在末端形成废袋,脱落以排除多余细胞质分顶体、核和鞭毛三部分,纤维的核区域被碱性品红染成红色,从前到后颜色逐渐加深

同真核精原细胞囊

圆形,体积变大,囊中空腔较大囊体进一步增大

两端均进行伸长,DNA逐渐减少,有废袋形成

细而短,无细胞核5龄幼虫

6龄幼虫初期和中期6龄幼虫中期限6龄幼虫末和蛹初期1～3日龄蛹

21.9±2.2

42.1±7.658.3±9.5

生精囊类型真核

精母细胞囊E1a初级精母细胞囊E1b次级精母细胞囊E1c精细胞囊E2伸长的精细胞囊E3

发育中的精子束E43日龄蛹至羽化

成熟的精子束E5无核

精原细胞囊A1a精母细胞囊A1b精细胞囊A2发育中的精子束A3成熟的精子束A47日龄蛹至羽化

顶体、核和鞭毛分别为26.2±1.3、23.3±1.7和407.7±26.9同真核39.4±4.050.2±4.3

218.4±6.51～8日龄蛹2～9日龄蛹3～10日龄蛹4日龄蛹至羽化5日龄蛹至羽化处理阶段

图2　高温处理组后期蛹精巢中EA、EA’和E5数量

Fig.2NumberofEAandE5inpupaeindifferenttreatmentwithhightemperature

2.2.3　高温胁迫对无核精子发生和形成的影响。高温对无核精子发生亦无显著的胁迫作用,而主要影响无核精子的形成,抑制精细胞囊伸长(图󰂭)。此效应主要发生在蛹期(图3)。6龄幼虫期高温处理,在蛹后期精巢中正常的精子束数量每头为320,与对照(3186条)无差异;蛹期高温处理,在蛹后期精巢中出现大量异常精细胞囊,每头达1349条,正常精子束数量为1517条,仅为对照的一半,精子发生总数为2866条,与对照无显

著差异。

2.3　对雄性中胚层生殖腺结构和分泌功能的影

处理阶段

图3　高温处理蛹精巢中无核精子束和异常精细胞囊数量Fig.3Numberofapyrenespermandabnormalspermatidcystinpupaeindifferenttreatmentwithhightemperature

响

高温对附腺和精包腺最大生长量无影响,但

能加快生殖腺的生长发育(图4、5)。蛹期和成虫分别高温处理,精包腺和附腺的最大生长量分别为13.53、14.65、5.78、6.15cm,与对照(14.56、6.

2期　　　　　　　　　　　　郭慧芳等:高温胁迫影响雄性棉铃虫生殖力的生理机制

12cm)无明显差异。但蛹期高温处理后0日龄蛾的附腺和精包腺分别比对照长22.3%和16.6%,成虫高温处理1日龄蛾的附腺和精包腺分别比对照长16.6%和8.4%。由图4、5还可看出,高温处理组和对照组的精包腺和附腺的长度在0到2日

龄范围内随蛾龄的增加而增加,2日龄达到最大生长量,到3日龄时各处理精包腺和附腺长度均略有下降,这可能是腺体分泌的结果。

图4　高温处理蛾附腺生长曲线

Fig.4Developmentofaccessoryglandwith

hightemperaturetreatment图5　高温处理后蛾精包腺生长曲线

Fig.5Developmentofspermatophoregland

withhightemperaturetreatment

　　对高温处理雄性不同虫态后雄蛾附腺和精包腺分泌物中蛋白质含量测定结果表明(表2),高温不影响附腺分泌蛋白量,仅影响了成虫期高温处理蛾的精包腺分泌蛋白量。蛹期、6龄幼虫和蛹期以及成虫期高温处理蛾,每对附腺分泌蛋白质量都在135～142Λg范围内,与对照(144.3Λg)无显著差异;蛹期、6龄幼虫和蛹期高温处理蛾每个精包腺分泌蛋白质量(214.3和207.3Λg)亦与对照(202.8Λg)无差异。成虫期高温处理蛾每个精包腺分泌蛋白质量为165.1Λg,极显著低于对照;可以推测成虫置高温下交配极显著影响卵受精,可能与高温抑制精包腺分泌蛋白能力有关。

表2　高温处理组雄蛾附腺和精包腺分泌物中的蛋白量Table2Proteincontentsecretedbyaccessoryandspermaphoreglandunderhightemperature处理阶段每对附腺󰃗单个精包腺󰃗ΛgΛg蛹期135.8±11.4214.3±8.06龄幼虫和蛹期141.3±20.7207.3±37.0成虫期138.9±6.1165.1±23.733对照144.3±9.3202.8±2.0注:测定蛾均为3日龄,每组为10头;33表示与对照在1%水平上的差异性。

3　讨论

3.1　高温与棉铃虫精子发生和形成

同其它鳞翅目昆虫一样[9,10],棉铃虫也具有

真核2无核精子交叉发生和形成过程。其中真核精子发生主要在幼虫期进行,在蛹初期随着向无核精子发生的转变真核精子发生中止,其规律性与同科的小地老虎相似[8]。高温不影响精子发生过程,而主要影响精子形成过程。棉铃虫在6龄幼虫期和蛹初期对高温敏感正是由于真核精子形成受阻,高温下精细胞囊不能进一步发育,这也与高温

对小地老虎和粘虫的影响相类似[5]。棉铃虫在33℃下生长发育正常而生殖发育受显著抑制,但小地老虎在34℃下生殖发育和生长发育都受到明显抑制。这两种昆虫生殖发育和生长发育高温敏感性差异不同。长期以来,对昆虫无核精子的功能缺乏明确的认识。曾推论无核精子对真核精子的移动、营养、存活乃至最终的受精作用都起至关重要的作用。从本试验结果看,棉铃虫蛹期高温使无核精子束数量减半,但对最终的受精作用并无影响。由此看来,无核精子是否具有上述重要的生理功能,或者无核精子在执行其功能时是否有数量的饱和,都还值得进一步探讨。

3.2　高温与生殖腺发育和分泌

关于高温对昆虫雄性附腺的影响已有一些研究,高温可导致家蚕、小地老虎附腺结构和分泌功能变化[6,7],但高温对精包腺的影响尚未见报道。试验表明,影响棉铃虫精子形成的33℃高温并未对雄性附腺有不良影响,仅影响昆虫生殖腺分泌蛋白质的能力。这解释了棉铃虫在成虫期高温为何生殖阻断。

3.3　高温诱导雄性不育的应用前景

辐射不育技术是在20世纪50年代开始用来防治害虫,已在螺旋蝇、地中海实蝇、瓜实蝇等防治上取得成功[11]。但辐射不育技术杀伤生殖细胞的同时也对体细胞产生极大影响,从而使不育蛾的交配竞争能力下降。高温对生殖细胞造成损伤而对体细胞无不良影响,由此产生的不育蛾有着极强交配能力,并且诱导不育方法简便快速,安全高效。因此同幅射不育相比高温不育具有明显的优越性,可为害虫防治提供一条新思路。

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