PCR产物测序实验操作流程
一、 实验试剂和耗材准备 （一）实验试剂
实验试剂 核酸提取试剂盒 上、下游引物 Extender PCR-to-Gel Master Mix，2× ddH2O 核酸荧光染料(4s Green) DNA Marker TBE电泳缓冲液 琼脂糖 核酸外切酶I (Exo I) 碱性磷酸酶(ALP) 经纯化后的PCR产物 BigDye v3.1 100%酒精 125mM EDTA（PH=8） 70%酒精 POP7胶 Hi-Di甲酰胺 毛细管电泳Buffer Sequence Standard（3500） 主要用途 主要用于DNA或RNA的提取（详细步骤参考相应说明书） PCR或测序反应 PCR PCR、测序反应及其它用途 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 PCR产物的纯化 PCR产物的纯化 测序反应 测序反应 测序产物纯化 测序产物纯化 测序产物纯化 上机测序过程（毛细管电泳） 上机测序过程（毛细管电泳） 上机测序过程（毛细管电泳） 测序标准品（阳性对照） （二）、实验耗材
实验耗材 1.5ml EP管 1.5mlEP管支架 0.2mlPCR管 八连管及八连管盖 96孔板 各种规格微量移液器 各种规格移液器吸头 96孔板支架 96孔板封垫 封板滚轮 主要用途 各种试剂的分装、盛放、储存等 1.5ml或2mlEP管的支撑或存放 PCR PCR PCR、测序反应及上机测序 微量试剂的定量和移取 配合移液器的使用（吸附试剂） 固定和支撑96孔板、八连管以及PCR单管 封板用 封板用 冰 各种规格量筒 锥形瓶 容量瓶 药匙和称量纸 凝胶槽和凝胶梳 计时器 记号笔 一次性手套 铝箔 维持待反应试剂低温环境 溶液的稀释或试剂的配置 琼脂糖凝胶的熔化 溶液的稀释与试剂的配置 试剂的称量 琼脂糖凝胶的凝固和加样孔的形成 计时 做各种记号或标记 防污染和保护作用 封96孔板 二、实验仪器
实验仪器 机 电冰箱 高速台式离心机 Mini式离心机 旋涡式混合振荡器 电子分析天平 核酸检测仪 PCR仪 电泳仪和水平电泳槽 凝胶成像仪 基因分析仪 蒸汽式高压湿热消毒器 电热鼓风干燥箱 恒温水浴锅 主要用途 试剂的储存 试剂的离心 瞬离试剂 混匀试剂 试剂的称量 核酸纯度和浓度的检测 PCR 琼脂糖凝胶电泳 核酸琼脂糖凝胶电泳的检测和分析 DNA的测序或片段分析 试剂、实验耗材及用具的消毒 实验用品的干燥 提供恒温环境 三、实验操作具体步骤 （一）核酸的提取
按照DNA或RNA提取试剂盒操作（具体操作步骤参考试剂盒操作说明书），如是RNA需进一步反转录为cDNA。-20℃保存备用。 （二）测序PCR模板的制备 （1）、预先制备适量冰
（2）、在冰上融化模板DNA、引物以及Extender PCR-to-Gel Master Mix （3）、按照以下反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上
成分 Extender PCR-to-Gel Master Mix，2× 10μM上游引物 10μM下游引物 50ng/μl的模板 ddH2O 体积（20μl体系） 10μl 0.5-2μl 0.5-2μl 0.1-1μl 根据需要 终浓度 1× 0.25-1μM 0.25-1μM 5-50ng — （4）将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序 95℃ 5min→
（95℃ 30sec，67℃ 30sec -0.5 ℃/循环，72℃ 1min）x14循环→ （95℃ 30sec，57℃ 30sec，72℃ 1min）x 30循环→ 72℃ 7min→4℃ Forever
（5）琼脂糖凝胶电泳检测:量取适量1×TBE缓冲液并称取一定量琼脂粉溶于其中制成1%-2%的琼脂糖凝胶，在微波炉上加热溶化，待温度降至60℃-70℃左右加入荧光染料，温度降至40℃-50℃左右将琼脂粉溶液倒入插有梳子的凝胶槽中冷却，待凝胶完全凝固备用。将凝胶置于水平电泳槽中，取少量PCR产物上样电泳，将电泳好的样品置于凝胶成像系统中进行检测和分析。
（6）将检测合格的PCR产物用酶解法进行纯化。根据核酸外切酶I (Exo I)，碱性磷酸酶(AIP)的作用浓度，加入到PCR反应产物中，37℃ 消化15min，85℃使酶失活15min。纯化体系如下：
PCR产物 Exo I 碱性磷酸酶 5μl 0.5μl 1μl （三）、纯化后的PCR产物的测序反应
1、纯化后的PCR产物按照1:3~1:6稀释（若琼脂糖凝胶电泳条带非常亮，
可以适当增大稀释倍数） 2、测序反应用引物稀释到1μM （1）PCR产物测序反应体系（10μl）：
成分 纯化并稀释好的PCR产物 引物（上游或者下游）1μM BigDye(2.5x) 10倍稀释 总体积 加入量 1μl（也可参考下表） 1μl 8μl 10μl PCR产物测序体系中PCR产物的加入量如下表：
DNA纯度：OD260/OD280=1.6~1.8；DNA含量（ng/μl）=OD260×50
PCR产物片段大小 100-200bp 200-500bp 500-1000bp 1000-2000bp 2000bp以上 加入量 1-3ng 3-10ng 5-20ng 10-40ng 20-50ng BigDye（2.5x）稀释10倍配方：
成分 BigDye（2.5x） Seq Buffer ddH2O 加入量 50ul 225ul 725ul （2）测序PCR循环条件： 一般测序： 96 °C 1 min →
(96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 4 min) x 25循环→ 4 °C保温 大分子测序： 95 °C 5 min →
(96 °C 30 sec → 50-55 °C 10 sec → 60 °C 4 min) x 50循环→
4 °C保温
（三）测序反应产物纯化（酒精/EDTA法）： 1、96孔板纯化方法：
（1）每管加入2.5μL 125 mM EDTA(pH=8)，加到管底；
（2）加入30 μL 100% 酒精，封严，震荡4次，室温放置15 min； 20°C最大转速离心45min，马上倒置96孔板， 倒置最小转速离心10s； （3）加入60 μL 70% 酒精，最大转速 4 °C离心15 min，马上倒置96孔板， 最小转速离心1 min ； （4）70%酒精重复洗涤1次或2次；
（5）让残余的酒精在室温挥发干，加入10 μL Hi-Di甲酰胺，95 °C变性4 min，迅速置冰上4 min ，上样电泳。 2、单个0.2 mL离心管离心方法：
（1）每孔加入2.5μL 125mM EDTA到溶液中，再加入30μL 100%酒精，盖好，震荡4次，室温15 min。
（2）台式离心机12000 x g 离心30 min，马上用吸尽上清液。 （3）每孔加入60 μL 70% 酒精，12000 x g 4°C离心15 min，马上用吸尽上清液。此步可以重复1次。
（4）让酒精在室温挥发干净，加入10 μL Hi-Di Formamide溶解DNA。 （5）在PCR仪上变性：95 °C 4 min，4 °C 4 min。上机电泳。
一般常见的纯化方式有三种：
（1） 酒精/EDTA 沉淀法：利用EDTA 螯合定序反应中的Mg2+离子，再加入酒精，经离心后使定序产物小片段沉淀，游离的荧光物质则悬浮于上清液中，小心地将上清液除去，再经过一次的酒精清洗沉淀物，则可以完全去除游离的荧光物质。此法的优点是可以将游离的荧光物质去除的非常干净，几乎完全没有背景值会影响序列判读，然而，其缺点是无法保留小分子量的片段，约第20个碱基开始才可以被读取出来。
（2） 酒精/EDTA/醋酸钠沉淀法：利用EDTA 螯合定序反应中的Mg2+离子，再依序加入醋酸钠（帮助沉淀）、酒精，经离心后使定序产物小片段沉淀，游离的荧光物质则悬浮于上清液中，小心地将上清液除去，再经过一次的酒精清洗沉淀物，则可以去除游离的荧光物质。此法的优点是可以保留住极小分子量的片段，使第一个碱基就可以被读取出来，然而，其缺点是无法完全去除游离的荧光物质，会有较高的背景值影响序列判读。
（3） 离心管柱纯化法：使用特殊的gel-filter，将定序反应产物小心地注入其中，经过低速离心，游离的荧光物会保留在gel 中，流出液则完全不含游离的荧光物。此法的优点是结合前面两种方法的优点--既可以读取到第一个碱基，背景值也完全被清除干净，也相当省时（只需7 分钟，前面2 种方法约需1 小时），然而，其缺点是昂贵。
